Ma `lumot

4.5: Transkript darajasidagi tahlil - Biologiya


Kirish

Protein borligini yoki konsentratsiyasini baholashning bir necha usullari mavjud. Bundan farqli o'laroq, bugun siz murakkab aralashmaning ko'pchiligidan faqat bittasi bo'lgan oqsilning kontsentratsiyasini o'lchashga harakat qilyapsiz.

Proteinlarni aniqlashning ajoyib usuli-bu antikorlarni ekspluatatsiya qilish-immunoglobulinlar deb ham ataladi-Western blotda yoki ELISA (fermentga bog'liq immunosorbent tahlil). Tabiiy fiziologik sharoitda (masalan, o'z tanangizda), antikorlar B hujayralari tomonidan patogenlarga javoban ajralib chiqadi. Berilgan antikor juda o'ziga xosdir (KD ~ nM) antijen deb ataladigan majburiy sherigi uchun va ma'lum bir odam uchun antikorlarning butun populyatsiyasi nihoyatda xilma -xil (> 10)7 noyob antikorlar). Xilma -xillik DNK darajasidagi rekombinatsiya jarayonlari va o'ziga xosligi oqsil tuzilishi bilan ta'minlanadi.

Antikor oqsillari og'ir va engil zanjirlarida doimiy (C) va o'zgaruvchan (V) mintaqalarni o'z ichiga oladi. C hududlari antitelalarga ta'sir qiluvchi funktsiyalarni aniqlaydi, masalan, infektsiyalangan hujayralarni antikorga bog'liq holda o'ldirish. V mintaqaning uchta o'zgaruvchan qismi birgalikda antijenni tanib oladigan joyni tashkil qiladi. Antigenning epitop deb ataladigan kichik bir qismi uning antikorlari tomonidan tan olinadi. Bu ~ 10 ta aminokislotalar mintaqasi chiziqli bo'lishi mumkin yoki u chiziqli uzoq mintaqalardan tashkil topgan bo'lishi mumkin va shuning uchun faqat antijen ona konfiguratsiyasida bo'lganda tan olinadi. Masalan, konformatsiyaga bog'liq antikorlar turli kollagen turlarini ajratish uchun foydalidir.

Antikoralarni hayvonlarda, maxsus hujayrali liniyalarda va hatto genetik muhandislikda ko'paytirish mumkin. Poliklonal antikorlarni (bir xil antijendagi aniq epitoplarni taniy oladigan antikorlar havzalari) hayvon zardobidan olish mumkin. Hayvon qiziqtiruvchi antijeni bilan kostimulyatsion signal borligida, odatda, bir necha marta infektsiyalanadi va keyin qon ketadi. Bunday holda, olingan antikorlarning katta qismi qiziqish antijeniga qarshi bo'lmaydi. Aksincha, monoklonal antikorlar ham o'ziga xos, ham sof bo'lishi mumkin. Bu jarayonda antikor ishlab chiqaruvchi oddiy B hujayralari miyelomadan olingan o'lmas B hujayralari bilan birlashadi va ikkita hujayra turi cheklangan samaradorlik bilan kimyoviy ishlov berish orqali eriydi. Faqat heterojen erigan hujayralarni tanlash uchun madaniyatlar faqat miyeloma hujayralari omon qololmaydigan muhitda saqlanadi (ko'pincha HAT muhiti). Oddiy B hujayralari vaqt o'tishi bilan tabiiy ravishda yo'q bo'lib ketadi, shuning uchun oxirigacha faqat gibridomalar deyiladi. Genetik muhandislik yordamida inson antikorlari "ramkasi" ni (barcha S va V mintaqaning bir qismini) boshqa turda (masalan, murina) topilgan antijenni aniqlash joyi bilan birlashtirish mumkin. Agar antitelalar terapevtik vosita sifatida ishlatilsa, bu bemor tanasi ularni begona deb hisoblash ehtimolini kamaytiradi, faqat sichqon genidan ishlab chiqarilgan antikorga nisbatan. Odatda, Y turidagi hayvonga X turidan antikor yuborish, ikkilamchi antikorlar deb ataladigan anti-X antikorlarni ishlab chiqarishga olib keladi. Bu texnik tahlillarda juda foydali bo'lishi mumkin, buni quyida ko'rasiz.

Bugun siz bilvosita ELISA tahlilida kollagenga qarshi antikorlardan foydalanasiz. O'ngdagi rasmda bilvosita va sendvichli ELISA ko'rsatilgan - nima uchun sezuvchanlik va o'ziga xoslik bo'yicha ELISA sendvichi eng yaxshi tahlil bo'lishi mumkinligini tushunasizmi? Bilvosita ELISAda, birinchi navbatda, ikki xil sharoitda olingan oqsil ekstraktlarini quduq plastinkalariga bog'lash kerak. Keyin siz tegishli quduqlarga ma'lum antijeni - kollagen I yoki kollagen II epitoplarini taniydigan asosiy antikorni qo'shasiz. (Aslida, antikorni qo'shishdan oldin, antitelaning o'ziga xos bo'lmagan bog'lanishiga yo'l qo'ymaslik uchun plastinkani sut oqsili bilan "to'sib qo'yasiz".) Keyin, ortiqcha antikorlarni yumshoq yuvish vositasi bilan yuvish kerak. Nihoyat, ikkilamchi antikorni, ya'ni birlamchi antikorni taniganni, qo'shish kerak. Ikkilamchi antikor ishqoriy fosfataza bilan konjugatsiyalanadi, u substrat ishtirokida kolorimetrik reaksiyaga kirishadi. Shunday qilib, substrat qo'shilgandan so'ng, oqsilning nisbiy miqdorini absorbans spektroskopiyasi yordamida aniqlash mumkin. Proteinning mutlaq miqdorini aniqlash uchun siz madaniyat namunalariga parallel ravishda kollagen standartining suyultirilishini o'tkazasiz. ELISA inkubatsiya bosqichida siz oxirgi marta tayyorlangan cDNA -larni jel bilan ishlatishingiz va tahlilni boshlashingiz mumkin.

Malumot: Abbos, A. K. va A. X. Lixtman. Uyali va molekulyar immunologiya. 5 -nashr. Filadelfiya, PA: Elsevier Sonders, 2005. ISBN: 9780721600086.

Protokollar

1 -qism: Elishayning birinchi kuni

Majburiy emas: butun oqsil konsentratsiyasini o'lchang

  1. Agar xohlasangiz, 2 -moduldagi Bredford tahlilidan foydalanib, oqsil ekstraktlarini sinab ko'rishingiz mumkin, so'ngra har bir namuna uchun qo'shadigan umumiy oqsil miqdorini normallashtiring.
  2. Siz oxir -oqibat kollagen II va kollagen I miqdorining nisbati sizni qiziqtirgani uchun, bu qadam mutlaqo zarur emas. Biroq, bu sizga boshqasidan ko'ra ko'proq ma'lumot beradi.

ELISA protokoli

Biz bu tahlilni 1-moduldagi lyuminestsent titrlash egri chizig'ida bo'lgani kabi 96 quduqli mikrotitrli plastinkada o'tkazamiz. Elishayda biz emissiya emas, balki ma'lum to'lqin uzunligida yutilish uchun sinov o'tkazamiz.

  1. Kollagen I tahliliga 96 ta quduqli plastinka, ikkinchisiga kollagen II tahlili sifatida teg qo'ying. (Nega biz alohida plitalardan foydalanishni xohlashimiz mumkin?)
  2. Bilvosita Elishayda birinchi qadam - bu sizning barcha namunalaringizni quduqlarga singdirishdir. Siz standart namunalarni xuddi shu plastinkada tayyorlashingiz kerak, ular sizning namunalaringiz bilan bir xil bo'ladi. Bu standartlar oqsil konsentratsiyasi uchun ma'lumot sifatida ishlatiladi. Standartlar ham, noma'lum namunalar ham quyidagi jadvalga muvofiq ikki nusxada bajariladi.

Tavsiya etilgan ELISA rejasi. Bu reja sizning kollagen I va kollagen II plastinkangiz uchun ishlatilishi mumkin. Har holda, 1 va 2 -ustunlar kollagen standartlarining dublikatlari, 3 -ustunda sizning tajriba namunalaringiz va fonni o'lchash uchun bir nechta quduqlar (BLANK deb belgilangan) mavjud.
1 ta kollagen2 STANDART3 NAMUNA
A10 mkg/ml10 mkg/ml (takroriy)1 -misol
B5"1 -namuna (dublikat)
C2.5"2 -misol
D1.25"2 -namuna (dublikat)
E.625 mkg/ml"Bo'sh
F312"Bo'sh
G516"Bo'sh
H78"Bo'sh
  1. Sizga har biri 10 mkg/ml bo'lgan kollagen I va II dan 250 mkl bo'lak beriladi. O'z standartlaringizni quyidagicha tayyorlang:
    • Oxir -oqibat, har bir standart kontsentratsiyaning har bir qudug'i uchun 50 ml ni, har bir standart uchun ikkita quduqni pipetka qilmoqchisiz.
    • Variant 1:
      • Har biri 120 mL PBS bo'lgan 7 ta eppendorf naychasini tayyorlang.
      • Birinchi eppendorf naychasiga 120 mkl 10 mkg/ml kollagen qo'shing va vorteks.
      • Endi standartdan 120 mkl (hozir 5 mkg/ml) oling va uni keyingi eppendorf naychasiga qo'shing.
      • Hammasi tugagach yoki ketayotganingizda, standartlarni tegishli quduqlarga pipetlang.
    • 2 -variant:
      • 50 mL PBSni B-H qatorlarining 1 va 2-chi quduqlariga pipetlang (A o'tkazib yuboring!).
      • 10 mkg/ml kollagenning 100 mLini tegishli quduqlarga (A1 va A2) tiqib oling.
      • Oddiy yoki ko'p kanalli pipetkadan foydalanib, bu eritmalarning 50 ml ni keyingi quduqlarga (B1 va B2) o'tkazing va PBS bilan aralashtiring.
      • Takrorlang, endi B quduqlaridagi 5 mkg/ml eritmaning 50 mklini C quduqlariga o'tkazing.
    • Bu usullarning har biriga ikki baravar suyultirish deyiladi. Sizningcha, qaysi yo'l kamroq xato qiladi?
  2. Endi 50 ml namunangizni tegishli quduqlarga qo'shing. Bo'sh quduqlar uchun siz PBS qo'shishingiz kerak.
  3. Ish tugagandan so'ng, har bir plastinkani (CN I va CNII) yoping, bug'lanishni yaxshiroq oldini olish uchun uni parafilm bilan o'rab oling va namunalarni 80 daqiqa turishiga ruxsat bering. Bu orada agarozli jelni o'rnating (2 -qism).
  4. Kuluçka muddati tugagandan so'ng, siz lavhani yuvasiz va keyin bloklaysiz.
    • Birinchidan, plastinkadagi eritmalarni lavaboga suring.
    • Ko'p kanalli pipetka va suv omboridan foydalanib, har bir quduqqa 200 ml yuvish buferini qo'shing, so'ng plastinani (qo'l bilan) bir necha soniya davomida muloyimlik bilan aylantiring.
    • Eritmalarni yana bir marta siljiting va keyin plastinkani qog'oz sochiq bilan arting. Siz plitalarni qattiq urishingiz mumkin, lekin ularni sindirish mumkin!
    • Yuvishni yana bir marta takrorlang.
    • Nihoyat, plastinkaga 200 mL blok bufer qo'shing. Yana 60-90 daqiqa kuting. Ayni paytda, tahlil ustida ishlang (3 -qism).
  5. Yuqorida bajarilgan yuvish bosqichini yana ikki marta chayish bilan takrorlang.
  6. Tayyor bo'lgach, o'qituvchilardan kollagenga qarshi antikorlarni so'rang (ular oxirgi daqiqada suyultirilishi kerak). Har bir quduqqa 100 ml suyultirilgan antikor qo'shing.
  7. Sizning namunalaringiz bir kechada antikor eritmasida qoldiriladi, so'ngra o'qituvchilar fakulteti tomonidan bufer blokirovkasiga qaytariladi.

2 -qism: PCR bo'laklarining agarozli jeli

  1. Bugun biz 1,2% agarozli jel ishlatamiz.
    • Bu tanlov bizga 1% jeldan ko'ra yaxshiroq ajratish imkonini beradi, lekin u bilan ishlash 3% jel kabi qiyin emas.
  2. 9 ta namuna uchun etarlicha suyultirilgan eritma tayyorlang: har bir namuna uchun 2 mL yuklovchi bo'yoq + 8 mkl steril suv.
  3. Har bir PCR mahsulotining 10 ml ni 10 mL suyultirilgan yuklash eritmasi bilan aralashtiring.
  4. Namunalaringizni quyidagi jadvalga muvofiq yuklang, har bir quduqqa bir xil miqdorda yuklashga ehtiyot bo'ling.
  5. Namunalar 125 V da ~ 45 daqiqa davomida ishlaydi. O'qituvchilar fakulteti sizga imkon qadar yuqori kontrastli rasmlarni olishga yordam beradi - bosh barmog'ingizni olib keling.
LANEKollagen turiMASALAYuklab olish hajmi (ml)
1Yo'q100 bosimli narvon10
2CN I1 -misol18
3CN I2 -misol18
4CN II1 -misol18
5CN II2 -misol18

3 -qism: ImageJ tahlilini boshlang

Bugun siz tasvirni tahlil qilish dasturidan foydalanasiz ImageJ. Bu NIH (Milliy sog'liqni saqlash institutlari) tomonidan bepul taqdim etiladi. Sizning maqsadingiz-GAPDH bilan birgalikda kuchaytiriladigan diapazonlarning intensivligiga qarab, kollagen II va kollagen I ning nisbiy miqdorlarini aniqlash. Bu tahlil ushbu modul tomonidan berilgan umumiy savolga bitta dalil beradi, xususan, xondrositlar fenotipining saqlanishiga (fibroblastlarning farqlanishiga qarshi) yoki ildiz hujayralari xondrogeneziga qanday omillar ta'sir qiladi va qay darajada? Agar siz transkript darajasidagi tahlilni tugatsangiz, siz jonli/o'lik ma'lumotlaringizni hisoblashga o'tishingiz mumkin.

Transkripsiya intensivligi

  • Yangi ajratilgan xondrositlar va mezenximal ildiz hujayralari uchun o'qituvchilar fakultetining ma'lumotlarini tahlil qilishdan boshlang.
    • Turli xil vaqtlarda olingan ikkita fayl mavjud:
    • Chapdan o'ngga namunalar: (narvon), CN I xondrosit, CN I ildiz hujayrasi, CN II kondrosit, CN II ildiz hujayrasi.
    • Har bir holatda, pastki diapazon GAPDH ichki nazorati hisoblanadi.
  1. Agaroz jeli tasvirini tanlab oching Fayl → Ochish
  2. To'rtburchaklar asbobidan foydalanib, jel fonidagi maydonni tanlang va uni o'lchash uchun ctrl-M tugmasini bosing. O'rtacha va maksimal intensivlikni Excel fayliga nusxalash va faylni saqlash.
  3. Endi har bir kollagen va GAPDH tasmalarini tanlang va har safar ctrl-M tugmalarini bosing. Hududni va o'rtacha intensivlikni, shuningdek saqlamoqchi bo'lgan boshqa ma'lumotlarni nusxa ko'chiring. Oxir -oqibat, siz CNII intensivligini har bir namuna uchun CNI diapazoniga ekvivalent tarzda solishtirishni xohlaysiz. Ma'lumotlarni tahlil qilish bo'yicha qabul qilingan qarorlarni asoslashga ishonch hosil qiling.
    • Bitta variant sifatida, o'rtacha intensivlikka chekka ta'sirlar (tasma xira bo'lgan) oldini olish uchun har bir bandning markazidan teng maydonlarni tanlashingiz mumkin.
    • Boshqa tomondan, agar ikkala chiziq ham bir xil darajada yorug 'bo'lsa, qalinroq tasma ko'proq DNKni ko'rsatadi. Shunday qilib, siz shunchaki intensivliklarni emas, balki har ikkala sohani va intensivlikni solishtirishni xohlashingiz mumkin. Har bir guruh uchun "umumiy piksellar sonini" olish uchun maydon va intensivlikdan foydalanish yo'lini o'ylay olasizmi?
    • Har qanday nisbatni olishdan oldin, har bir namuna diapazonidan fon intensivligini olib tashlashingiz mumkin.
  4. Birinchidan, ildiz hujayralari va xondrositlar uchun kutilgan CNII/GAPDH va CNI/GAPDH nisbatlariga e'tibor bering. Iloji bo'lsa, siz CNII/CNI normallashtirilgan nisbatlarini olishingiz mumkin. Ildiz hujayralari uchun buni qilishda qanday muammo bor?
  5. Nihoyat, siz o'z ma'lumotlaringizni tahlil qilishingiz va xondrositlar va ildiz hujayralariga nisbatan qaerga tushishini ko'rishingiz mumkin.
  6. Agar vaqtingiz bo'lsa, ImageJ-da o'rnatilgan jel tahlil dasturini o'rganishingiz mumkin.

4 -qism: Hujayra hayotiyligi

Hujayralarni hisoblash

Bu bo'limda sizning maqsadingiz tirik va o'lik xujayralarni qo'l bilan hisoblashning zarurligini va natijasini yarim avtomatlashtirilgan tasvirli tahlil yordamida solishtirish bo'ladi. Ish tugagandan so'ng, siz qanday sharoitda u yoki bu usulni afzal ko'rishni o'ylab ko'rishingiz mumkin.

  1. Tanlash orqali jonli hujayra tasvirini (yashil filtr) oching Fayl → Ochish
  2. Chiziq asbobini tanlang va odatdagi katakning diametri bo'ylab chiziq torting
  3. Tanlang Tahlil qilish → O'lchovni o'rnatishva 10 mkm ostiga qo'ying Ma'lum masofa
    • E'tibor bering: kameradan aniq piksel ma'lumotlarini olish o'rniga, biz hujayraning o'rtacha hajmini kiritamiz
  4. Yordamida tasviringizni kulrang shkalaga aylantiring Rasm → Turi → 8-bit
  5. Endi siz qandaydir tarzda hujayralarni fondan tanlashingiz kerak
    • Buning bir usuli - tanlash Jarayon → Ikkilik → Ikkilik qilish. Biroq, siz hujayralar klasterlari bitta hujayra sifatida "o'qilishini" topishingiz mumkin.
    • Yaxshilangan usul - bu foydalanish Rasm → sozlash → chegara. Siz tasviringizdagi ob'ektlarni belgilaydigan yuqori va pastki chegara intensivligini o'rnatishingiz mumkin. Hujayralaringiz qizil rangga to'lguncha, lekin iloji boricha boshqa hujayralar bilan bir -biriga to'g'ri kelmaguncha, intensivlik slayderlari bilan o'ynang.
  6. Endi siz ob'ektlarni sanashingiz mumkin. Tanlang Tahlil qilish → Zarrachalarni tahlil qilishva ni tanlang Ko'rsatish → Anahatlar, Natijalarni ko'rsatish, Xulosa qilingva Rekord statistikasi. Hujayra o'lchamidagi ob'ektlar uchun ham oqilona maydonni tanlang (diametri emas!).
  7. Bu jarayon bilan biroz o'ynashga harakat qilib ko'ring - avtomatik algoritm sizning ko'zingizdek yaxshi bo'lishi uchun sizda boshqa o'zgarishlar bo'lishi mumkinmi?
  8. Sizning yakuniy natijalaringizni (qo'lda va eng yaxshi avtomatlashtirilgan) daftaringizga yozib oling, har bir namuna uchun. O'lik hujayralarni ham sanashni va tirik hujayralardan bu sonni olib tashlashni unutmang (chunki biz ishlatgan filtrda birdan yashil va qizil hujayralar ko'rsatiladi).

Statistik tahlil

Siz xursand bo'lgan hujayralar soni (avtomatlashtirilgan yoki qo'lda bo'lsin) bo'lgach, siz asosiy statistik tahlillarni bajarishingiz mumkin.

  1. Excel faylidan boshlang (XLS3 -darsda muhokama qilingan asosiy statistik manipulyatsiyalarni bajarish uchun ramka sifatida. Fayl asl nusxasidan Bevin Engelvard tomonidan o'zgartirilgan. Ruxsat bilan ishlatiladi.
  2. Ikkala namunaning har biri uchun tirik hujayralar sonining 95% ishonch oralig'ini va/yoki tirik hujayra foizini toping va tuzing.
    • Hisob -kitoblarni foizga qarashning afzalliklari va kamchiliklari qanday? Qanday holatlarda hisob -kitoblarni ko'rib chiqish noto'g'ri bo'ladi?
  3. Ikkala namunangizning vositalarini (sonini va/yoki foizini) solishtiring. Qaysi ishonch darajasida (agar mavjud bo'lsa) ular farq qiladi?

Reaktivlar ro'yxati

  • ELISA yechimlari
    • PBS EMD planshetlaridan tiklandi
      • 140 mm NaCl
      • 10 mm fosfat buferi
      • 3 mm KCl
      • pH 7.4
    • Tamponni yuvish
      • PBS
      • 0.05 % 20 oralig'ida
    • Buferni blokirovka qilish
      • PBS
      • 5 % quruq sut
  • ELISA kollageniga xos reaktivlar
    • Hammasi GeneTex -dan
    • Kollagen I standarti, PBSda 1 mg/ml dan suyultiriladi
    • Kollagen II standarti, PBSda 1 mg/ml dan suyultiriladi
    • Kollagen I antikori, PBSda 1 mg/ml dan 1: 4000 nisbatda suyultiriladi
    • Kollagen II antikori, PBSda 1 mg/ml dan 1: 4000 nisbatda suyultiriladi

Tarmoqlarning korrelyatsion tahlili natijasida urug'lanish jarayonida metabolik va transkripsiya holatining ketma-ket qayta tashkil etilishi va arabidopsis ko'chatlarini rivojlanishida gen-metabolit munosabatlari aniqlanadi.

Ozuqa moddalarining mavjudligini yaxlit profil va tizimli biologiya tadqiqotlari turli xil ozuqa moddalari va metabolitlarga gen ekspresyonining javob berish mexanizmlari to'g'risida ko'proq ma'lumot beradi. Rivojlanish jarayonida keskin o'zgarishi mumkin bo'lgan endogen metabolitlarning gen ekspresiyasiga ta'sir qilish mexanizmlari haqida kam narsa ma'lum. Transkripsiya va metabolik holatlarni o'rganish va ko'chatlarning heterotrofik-avtotrofik o'tish davrida gen ekspresiyasiga ta'sir etuvchi metabolitlarni aniqlash uchun maqsadli bo'lmagan profil ma'lumotlariga ko'p o'zgaruvchan statistika va korrelyatsion tarmoqni tahlil qilish usullari qo'llanildi.

Natijalar

Mikroarrayga asoslangan transkript profillari Arabidopsis urug'lari ekstrakti yoki sakkiz kungacha emirilishidan yig'ilgan ko'chatlardan olingan. Tegishli namunalar uchun 1 ta H-NMR metabolit profillari olingan. Transkripsiya ma'lumotlarini tahlil qilish natijasida, ko'chatlar paydo bo'lishi natijasida yuqori differentsial gen ekspressiyasi aniqlandi, so'ngra kamroq o'zgarish sodir bo'ldi. Differentsial gen ifodasi asta-sekin 8-kungacha oshdi va ikki kunni ko'rsatdi, 5 va 7, yuqori tartibga solinadigan genlar, shu jumladan transkripsiya omili/signal genlari. Tarmoq kartografiyasi bahorni joylashtirish yordamida bir -biri bilan chambarchas bog'liq bo'lgan metabolitlarning ikkita asosiy klasterini aniqladi, ular vaqtinchalik farqli metabolik holatlarni aks ettiradi. Printsipial komponentlar profil ma'lumotlarining har ikkala to'plamini tahlil qilish vaqtlar sonining xronologik tarqalishiga olib keldi, bu esa rivojlanish seriyasidan kutilgan edi. Transkripsiya ma'lumotlarining tarmoq kartografiyasi 0 dan 2 kungacha va 3 dan 8 gacha bo'lgan kunlarni o'z ichiga olgan ikkita alohida klasterni ishlab chiqardi, shu bilan birga metabolit ma'lumotlarining tegishli tahlili 2 -kunning 3 -dan 8 -guruhga o'tishini aniqladi. Barcha vaqt nuqtalarini o'z ichiga olgan metabolit va transkript juftligi bo'yicha korrelyatsion tahlil 237 ta juda muhim korrelyatsiyani berdi. Saxaroza bilan bog'liq bo'lgan 129 genning 44 tasi saxaroza ta'sirchanligi ma'lum bo'lgan, shu jumladan transkripsiyaning bir qancha omillari.

Xulosa

Nihol va ekish paytida mikroto'lqinlarni tahlil qilish, rivojlanish davrlari bilan bog'liq bo'lgan vaqt oralig'ida transkripsiya faoliyatida katta o'zgarishlarni aniqladi. Tarmoqli kartografiya bahorga o'ralgan holda, oziqlanish uchun muhim bo'lgan metabolitlar holatining siljishi ko'chat paydo bo'lishigacha bo'lgan transkripsiya holatining keskin o'zgarishini ko'rsatadi. Transkripsiya va metabolitlar darajasining juft-juft chiziqli korrelyatsiyasi metabolitlar ta'sirida bo'lgan ko'plab genlarni aniqladi va ko'chat ekish paytida gen ekspresiyasini metabolitlar regulyatsiyasini o'rganish uchun boshqa maqsadlarni taqdim etdi.


Kirish

Tartiblash texnologiyalari transkriptom tadqiqotini o'tkazish uslubimizga katta ta'sir ko'rsatdi, bu esa RNAseq yordamida biologik namunadagi transkriptlarning butun vaqtiga kirishga imkon berdi.RNAseq ilovalari namunalar orasidagi differentsial transkript yoki gen ekspressiyasini klassik baholashdan [1], gen ekspozitsiyasi dinamikasining tavsifi [2], gen chegaralari [3, 4], tarjima samaradorligi [5] yoki RNK kabi turli xil muammolargacha. oqsillarning o'zaro ta'siri [6, 7], bir nechtasini aytish mumkin. So'nggi bir necha yil ichida ikkita RNAseq ilovasi transkripsiya tartibga solishning murakkabligi va xilma-xilligini tasvirlashga alohida qiziqish uyg'otdi-bitta hujayrali RNAseq [8] va keng miqyosda muqobil biriktirishni o'rganish [9, 10]. Ommaviy RNAseq eksperimentlari hujayralar populyatsiyasida o'rtacha gen ekspresiyasini o'tkazadi va shu tariqa hujayradan hujayraga o'zgaruvchanlikni ta'qiqlaydi. Bu RNAseq [8] uchun bitta hujayrali strategiyani ishlab chiqishga turtki bo'ldi va o'sha paytdan boshlab strategiyani takomillashtirishga tinimsiz harakat qilmoqda. Hozirgi kungacha bitta hujayrali RNAseq hujayra differentsiatsiyasi [11,12,13,14,15], murakkab to'qima va noyob hujayralar populyatsiyasi tarkibi [16,17,18,19] yoki o'smalarning heterojenligi [20, 21] haqida qimmatli ma'lumot berdi. ] va o'sish [22], va bu biologik tadqiqotlarda eng ilg'or texnologiyani tashkil etadi. Izoform transkriptomika sohasiga kelsak, dastlabki tadqiqotlar fenotipik murakkablikning qo'shimcha qatlami sifatida talqin qilingan to'qima uchun xos bo'lgan va rivojlanayotgan alternativ biriktiruvchi (AS) hodisalarning yuqori darajasini ko'rsatdi [9, 10, 23,24,25]. O'shandan beri, RNAseq biologik jarayonlarda, ya'ni hujayralarning ko'payishi va omon qolishi, differentsiatsiyasi, gomeostaz, stressga javoblar va kasallik o'zgarganda, aniqlangan rolga ega bo'lgan AS hodisalarining ko'payishini tavsiflashga xizmat qildi. Bu hodisalar va ularni tartibga solish mexanizmlari so'nggi bir necha yil ichida [23, 26,27,28,29,30,31] yaxshilab ko'rib chiqilib, muqobil biriktirish tushunchasini murakkab, qat'iy tartibga solingan, funktsional jihatdan bog'liq jarayon sifatida belgilab berdi. hali ham global miqyosda yaxshi tushunilmagan. Bundan tashqari, ularning biologik ahamiyatliligi atrofida munozaralar davom etmoqda [32,33,34].

Bir hujayrali RNAseq va ko'p darajali muqobil biriktirish tadqiqotlarining ko'pligidan farqli o'laroq, izoformlarning o'zgaruvchanligini hal qilish uchun bitta hujayrali transkriptom profilini qo'llash hollari kam uchraydi (1-jadval). Biroq, adabiyotda mavjud bo'lgan bo'shliq taklif qilganidan farqli o'laroq, muqobil izoformalarning ifodalanish naqshlari haqidagi ba'zi savollarga javob berish uchun katta hajmdan tashqariga chiqishga jur'at etish juda muhimdir. Yagona hujayralarda [35,36,37,38] izoformli ifoda mexanizmlarida yaqinda topilgan heterojenlik ilmiy jamoani juda qiziqtiradi va bu xilma -xil va izoformli ifodali landshaft gen ekspresiyasini tartibga solishning qo'shimcha qatlamini tashkil etadimi yoki yo'qmi degan savolni tug'diradi. Bu muqobil biriktiruvchi mashinaning stoxastik ishlashi natijasidir. Hech shubha yo'qki, bitta hujayrali izoformli tadqiqotlar bu asosiy muammoni hal qilishda kalit bo'lishi mumkin.

Izoformlarning transkriptom darajasidagi tahlillari bitta hujayrali RNAseq gen ekspression nashrlari [35, 39] yoki izoformlarning xilma-xilligi [40] bo'yicha o'tkazilgan, lekin faqat kontseptsiya isboti sifatida amalga oshirilgan. Odatda, bu tadqiqotlarning maqsadi hech qachon bitta hujayrali izoformlarning xilma-xilligini hal qilish emas, balki ushbu stsenariyda eksperimental protokollar yoki hisoblash vositalarining ishlashini tekshirish edi. Bunday cheklangan doirada, ilgari o'tkazilgan tadqiqotlar, bitta hujayralar orasidagi shovqinni bir-biridan ajratib turadigan oz sonli farqlarni aniqladi va natijalarni chuqur baholamadi. Bir necha yillar davomida faqat bitta hujayrali izoformli tadqiqotlarda RNAseq uchun ishlab chiqilgan usullar, asosan "izoformlarning aralashmasi" (MISO) [41] ishlatilgan [35, 36] va yaqin vaqtgacha o'ziga xos xususiyatlarga mos keladigan hisoblash strategiyasi qo'llanilmagan. bir hujayrali RNAseq paydo bo'la boshladi [38, 42, 43]. Ta'kidlash joizki, izoform tuzilmasini har tomonlama tahlil qilish uchun qisqa o'qish ketma-ketligi va asboblarning yo'qligi ko'pgina tadqiqotlarni faqat ekson qo'shilish darajasini [35, 36, 38, 39, 43] yoki transkriptlarning ma'lum hududlarini nishonga olish bilan cheklab qo'ydi. muqobil poliadenilatsiyalash joylari uchun 3 'tarjima qilinmagan mintaqa (UTR) [44] yoki transkripsiya boshlanadigan joylar uchun 5' UTR [TSS] [45]. Biroq, bitta molekulali ketma-ketlik texnologiyasini qo'llagan so'nggi tadqiqotlar cheklangan miqdordagi hujayralarda (to'rtdan oltigacha) to'liq izoformli tuzilmalarni [46, 47] tavsiflashda muvaffaqiyat qozondi, bunda butun muqobil biriktiruvchi hodisalarni o'z ichiga oladi. Ta'kidlash joizki, yuqorida keltirilgan tadqiqotlarning aksariyati hamma uchun ochiq bo'lgan hisoblash usullari (ya'ni [41, 48]) va ma'lumotlar to'plamlaridan (ya'ni [17, 18, 36, 49, 50]) foydalanadi (1-jadval).

Bir hujayrali izoformli tadqiqotlar doirasida ma'lumotlarni yaratish uchun kutubxona tayyorlash va ketma-ketlik texnologiyasining uchta kombinatsiyasi mavjud (1a-rasm):

Qisqa o'qiladigan texnologiyalarda (Illumina) kutubxonani tayyorlash strategiyasiga qarab ikkita usulni ajratish mumkin:

MI UMI-ga asoslangan usullar 3 ′ yoki 5 ′ qismli bo'laklardan qisqa o'qishlarni ta'minlaydi va amplifikatsiya tarafdorligini hisobga olish vositasi sifatida noyob molekulyar identifikatorni (UMI) o'z ichiga oladi.

○ Aqlli usullar transkriptning butun uzunligini qamrab oladigan qisqa o'qishlarni ta'minlaydi, lekin aniqroq ifoda miqdorini aniqlash uchun UMI-ni joylashtira olmaydi.

Uzoq o'qiladigan texnologiyalar (aka bir molekulali ketma-ketlik), aksincha, bitta ketma-ket o'qishda butun transkript molekulasini oladi.

Bir hujayrali mRNK sekansirovkasi usullari va mRNK o'zgaruvchanlik manbalari. a Bir hujayrali izoformli tadqiqotlarga uslubiy yondashuvlar. Kutubxona tayyorlash va ketma -ketlik texnologiyalarining kombinatsiyasi izoformlarning xilma -xilligini aniqlashning uchta alohida usulini beradi. UMI-ga asoslangan usullar 3 ′ (yoki 5-sonli) ketma-ketlik bilan chegaralanadi, bu UMI-larni samarali ishlatishga imkon beradi, ular gen darajasida ifodani miqdoriy aniqlash uchun juda mos bo'lsa ham, erta hujayrali shtrix-koddan tashqari, PCR-ni noto'g'ri aniqlash imkonini beradi. Aqlli usullar transkriptning butun uzunligi bo'yicha qisqa o'qishlarni amalga oshiradi, garchi ular kech uyali shtrix-kodlashni talab qilsa (shtrix-kodlar tagmentatsiyaga kiritilgan), UMI-larga mos kelmaydi va o'qishni izoformga aniq belgilash qiyin bo'lishi mumkin. Bitta molekulali ketma-ketlik har bir transkript molekulasini bitta o'qishda tartiblash imkonini beradi va izoformli to'liq ulanishni ta'minlaydi, garchi u ketma-ketlikdagi xatolarning yuqori tarqalishidan aziyat cheksa. b Muqobil izoformlarni keltirib chiqaradigan transkriptning o'zgarishi manbalari va ularning transkript bo'ylab joylashuvi. Yo'naltiruvchi izoform bilan taqqoslaganda (qulaylik uchun, barcha ekzonlar, intronlar va to'liq UTRlarni hisobga olmaganda), alternativ TSSlar (transkripsiyaning boshlanish joylari) va TTSlar (transkripsiyani tugatish joylari) UTRlarning qisqarishi natijasida hosil bo'ladi. Pre-mRNKni qayta ishlash natijasida intron va ekzonlar yo'q qilinadi yoki saqlanib qoladi, gendan hosil bo'lishi mumkin bo'lgan izoformlarga o'zgaruvchanlik qo'shiladi. Bundan tashqari, bir xil izoformada bir vaqtning o'zida bir nechta hodisa bo'lishi mumkin, natijada AS hodisalarining mumkin bo'lgan kombinatsiyasi soniga qarab izoform xilma -xilligi oshadi. Boshqa muqobil, RT teskari transkripsiya, UMI noyob molekulyar identifikator

Bu erda biz AS va izoformli ifodani qo'llashda ushbu uchta uslubiy yondashuvning cheklanishlarini belgilashga e'tibor qaratamiz. Shu maqsadda biz birinchi navbatda izoformni muvaffaqiyatli o'rganish uchun ideal talablar to'plamini tuzamiz va ular bir hujayrali RNAseq nashrlarida qanchalik bajarilganligini baholaymiz (1-jadval). Ushbu tahlildan olingan ma'lumotlarga asoslanib, biz haqiqiy hisoblash tajribasini uch usulning har biriga xos bo'lgan cheklovchi omillarni ochib beradigan oddiy hisoblash simulyatsiyasini ko'rsatamiz. Nihoyat, biz bir hujayrali izoformli tadqiqotlar hal qila oladigan biologik savollar va yondashuvning kelajakdagi istiqbollarini muhokama qilamiz.


Natijalar va muhokama

Bizning sodda CD4+ T hujayralarini tahlil qilish uchun biz quyidagi yondashuvni oldik. Birinchidan, biz individual omesni tavsiflashdan boshladik. Shundan so'ng, ma'lumotlar turlarining o'zaro bog'liqligini miqdoriy va sifat jihatidan baholash uchun ma'lumotlarimiz juftlikdan kesilgan. Bu ko'p omikli integratsiya bizga RNKni tahrirlash, allellarga xos ifoda va proteomik qidirish strategiyamizni sozlash bo'yicha tushuncha olishimizga imkon berdi. Nihoyat, biz T -hujayrali immunologik javobning asosidagi uyali mexanizmlarni o'rganish uchun sodda va xotirali CD4+ T hujayralarining metilom, transkriptom, proteom va fosfoproteomlarining qiyosiy tahlilini o'tkazdik. Bu sodda CD4+ T hujayralarining antigen tajribasidan so'ng molekulyar o'zgarishlarni aniqlash uchun juftlik yondashuvini ham, yo'l darajasini integratsiyalashuvini ham talab qildi.

Genomik o'zgarishlar va ularning oqsillarni kodlash hududlariga potentsial ta'siri

3.3 × 10 6 SNP, 1.75 × 10 5 qo'shish va 1.9 × 10 5 genom bo'ylab o'chirish (Qo'shimcha fayl 2: S2A -rasm). Protein kodlovchi genlar ichida 16000 ga yaqin SNP, 130 qo'shish va 109 o'chirish topildi. Bu ketma -ketlikdagi o'zgarishlar 107 ta to'xtash kodonini, 14 ta uzluksiz mutatsiyani va 109 ta kadr siljishini keltirib chiqardi. Protein kodlovchi mintaqalardagi SNPlarning ko'pchiligi sinonim bo'lgan yoki aminokislotalarning konservativ o'zgarishlari kiritilgan (Qo'shimcha fayl 2: S2B-rasm). G-oqsil biriktirilgan retseptorlari, immunoglobulinlar, hujayra yuzasi/membrana oqsillari va ion kanallari, jumladan, hujayradan tashqari muhit bilan bog'liq bo'lgan 7,271 ta sinonim bo'lmagan o'zgarishlar ro'y berdi (2-fayl: S2C-rasm). Bu yaqinda o'tkazilgan kuzatuvlar bilan mos keladi, chunki potentsial funktsiyalar yo'qolishi sog'lom odamlarda, ayniqsa, bir nechta analogli gen oilalarida uchraydi [7]. Yuzaki yoki yashirin molekulalarning variantlari ma'lum bir populyatsiyada mavjud bo'lgan immunitet reaktsiyalari va ozuqa moddalarining emirilishining keng heterojenligini hisobga olishi mumkinligi haqidagi anekdot kuzatuvlar mavjud [8-10].

Sinonim bo'lmagan o'zgarishlarga ega genlar orasida MAP2K3 Gomozigotli variant mavjud bo'lib, u erta to'xtash kodonini kiritdi, natijada ularning ko'p qismi kesiladi MAP2K3 kinaz domeni. Bu, ayniqsa, e'tiborga loyiqdir MAP2K3 ning faollashuvida ishtirok etadi p38-xaritabu o'z navbatida hujayra tsiklini tartibga solish va apoptoz kabi bir nechta genlarning transkripsiyasini rag'batlantirishi ko'rsatildi p53 va MYC [11, 12]. Protein funktsiyasining yo'qolishiga olib keladigan boshqa gomozigotli variant fosfolipaza ichiga kiritilishi edi PLCD3 bu ramka siljishini joriy qildi. Bu mutatsiya fosfatidilinositol 4, 5-bifosfatning diatsilgliserol va 1,4,5-trifosfat inozitoliga (IP3) gidrolizlanishi uchun javob beradigan PLC va C2 ​​domenlarining yo'qolishiga olib keldi. Bu topilmalar hayratlanarli, chunki hujayralar sog'lom ixtiyoriy donordan olingan va ta'sirlangan yo'llarning kompensatsion mexanizmlari bo'lishi mumkinligini aks ettiradi. Ta'kidlash joizki, yaqinda bu ikki funktsional buzilish mutatsiyalari ko'p populyatsiyali sog'lom odamlarning genomlarida tez-tez uchrab turadi [7].

Soddalashtirilgan CD4+ T hujayralarining transkriptom manzarasi

Biz sodda CD4+ T hujayralarining transkriptomini juftlashgan RNK ketma-ketligi yordamida tuzdik. Yig'ilgan transkriptlarning ko'pligi FPKM yordamida baholandi (har bir million bo'lak boshiga ekonning bir parchasi) va bimodal taqsimot ko'rsatildi (3 -qo'shimcha fayl: 3 -rasm). Ushbu ikkita taqsimotni modellashtirish uchun Gauss aralashmasi modeli qo'llanilgan. Har bir cho'qqining ostidagi transkriptlarning tahlili shuni ko'rsatdiki, FPKM past cho'qqisida transkriptlar mavjud bo'lib, ular shovqin deb hisoblaydigan bir nechta qo'llab -quvvatlanadigan o'qishlarga ega. Chap tepalikning o'rtacha ko'rsatkichidan (0.860) ikkita standart og'ish FPKM chegarasi bilan biz & gt13000 transkripsiya qilingan genlarni topdik.

24000 transkript (2a -rasm. 4 -qo'shimcha fayl: S1 -jadval). Kutilganidek, biz Th1 (IL2RA, IL2RB, IL2RG, IFNGR1 va IL12RB1), Th2 (IL4R va IL10RB) va Th17 (IL17RA, IL17RC) kabi CD4+ T hujayralarining yaxshi aniqlangan yordamchi yordamchilari bilan bog'liq bo'lgan bir nechta sitokin retseptorlari ifodasini aniqladik. , IL21R). Umuman olganda, sitokinlar, sitokin retseptorlari, asosiy gistokompanitsiya kompleksi va hujayra yuzasi oqsillarini kodlovchi genlar (masalan, CD4) o'rtacha darajadan yuqori darajada ifodalangan. Kutilganidek, eng ko'p ifodalangan genlarga ribosomal oqsillar va ribosomal RNKni kodlaydiganlar kiradi. Biz qo'shimcha & gt2000 ta yangi transkript va & gt6000 ta qo'shilgan izoformani aniqladik. Biz tasodifiy tanlangan yangi transkriptlar to'plamini RT-PCR amplifikatsiyasi va soddalashtirilgan CD4+ T hujayralari, shu jumladan birlamchi immun hujayralar panelida tasniflash orqali tasdiqladik. Etti transkriptning ikkitasi hamma tekshirilgan birlamchi immun hujayralarida namoyon bo'ladi, boshqalari esa T hujayralariga nisbatan xosdir (2b -rasm).

Oddiy CD4+ T hujayralarining transkriptomasi. a Soddalashtirilgan CD4+ T hujayralarida aniqlangan turli xil transkriptlar sonini ifodalovchi pastadirli jadval. b Agar gematopoetik hujayralar turlaridan ajratilgan RNKdan PCR bilan kuchaytirilgan mahsulotlar tasvirlangan agaroz jeli. Yuqoridagi yorliqlarda hujayralar tozalangan sirt markerlari ko'rsatilgan va yon tomonidagi teglar har bir transkript uchun manjetlar identifikatorini ko'rsatadi.

Keyin biz sodda CD4+ T hujayralarining miRNA profilini tekshirdik. miRNA-Seq miRdeep2 yordamida moslashtirilgan 7,6 million o'qishni yaratdi, 629 ta ma'lum miRNA va 15 ta yangi miRNA ni aniqladi (Qo'shimcha fayl 6: S3-jadval). Bu yangi miRNKlar miRNAlarning o'ziga xos xususiyatlariga, shu jumladan, soch tolasi shakllanishiga, barqaror ildiz halqasining tuzilishiga, shuningdek, 7-rasmda ko'rsatilgandek, etuk va yulduzlar ketma-ketligiga asoslanib aniqlandi: S4-rasm. O'qishlarning 99,9 % dan ko'prog'i 283 miRNKga to'g'ri keladi, bu shuni ko'rsatadiki, bu sodda CD4+ T hujayralarida ifodalangan miRNAlarning asosiy havzasini tashkil qiladi. Oldin e'lon qilingan usuldan foydalanib, biz FPKM ning ekanligini aniqladik

73 har bir hujayradagi bitta miRNA nusxasiga to'g'ri keladi

50 % miRNAlar hujayrada kamida bitta nusxada mavjudligini aniqladi

13 %, kamida 100 nusxa [13].

Naif CD4+ T hujayralarining proteyomik profili

Biz ko'p o'lchovli ajratish usullarini, shuningdek yadro, membrana va sitozolni hujayralararo bo'linishi yordamida sodda CD4+ T hujayralarini chuqur proteomik tahlilini o'tkazdik [1, 13]. Hammasi bo'lib 7449 gen bilan kodlangan oqsillar aniqlandi (Qo'shimcha fayl 8: S4 -jadval). Oddiy CD4+ T hujayralarida ifodalangan oqsillarning ko'pligini aniqlash uchun biz intensivlikka asoslangan mutlaq miqdorni (iBAQ) [14] ishlatdik (3a-rasm). Transkriptom ma'lumotlari bilan kelishilgan holda, hujayra yuzasi oqsillari va gistokompanitsiya kompleksining tarkibiy qismlari mo'l -ko'l ifodalanganligi aniqlandi. Kutilganidek, biz bir nechta sitokin retseptorlarini aniqladik, jumladan IL2RG (CD132), bir nechta sitokin retseptorlari (IL2, IL4, IL9, IL15 va IL21) tomonidan taqsimlanadigan umumiy gamma zanjiri, T hujayrali signalizatsiyasida muhim rol o'ynaydi [15]. Qizig'i shundaki, biz IL7R bilan hamkorlik qiluvchi va epiteliya hujayralari chiqaradigan asosiy sitokin bo'lgan TSLP uchun retseptor vazifasini o'taydigan CRLF2 ni aniqladik [16-18]. TSLP signalizatsiyasining hozirgi paradigmasi shuni ko'rsatadiki, TSLP CD4 T hujayralari funktsiyasiga, gomeostazga va patogen ta'sirga dendrit hujayralarini modulyatsiyasi orqali ta'sir qiladi. Biroq, TSLP yallig'lanish paytida ajralib chiqadigan eng qadimgi sitokinlardan biri ekanligini va CRLF2 va IL7R sodda CD4+ T hujayralarida birgalikda ifodalanganligini hisobga olsak, bu natijalar sodda CD4+ T hujayralari yallig'lanishni mahalliy darajada TSLP signalizatsiyasi orqali sezishi mumkin bo'lgan stsenariyni ko'rsatadi. murakkab

Oddiy CD4+ T hujayralarida ifodalangan oqsillarning nisbiy ko'pligiga qarab taqsimlanishi. a Sodda CD4+ T hujayralarida aniqlangan oqsillarning taqsimlanishi va ularning me'yorlashtirilgan iBAQ (log2) qiymatlariga mos keladigan ko'pligi. Qizil rangda ko'rsatilgan genlar NCBI RefSeq 62 da olib tashlangan, ammo proteomik tadqiqotlarimizda aniqlangan genlarni ko'rsatadi. b Bizning tadqiqotimizda aniqlangan RefSeq izohli gipotetik oqsillar to'plamining taxmin qilingan domen arxitekturasi

Biz umumiy ma'lumotlar bazalarida ochiq o'qish ramkalari (ORF) sifatida izohlangan 162 oqsilni aniqladik (Qo'shimcha fayl 9: S5 -jadval). Bu oqsillarning ba'zilari sodda CD4+ T hujayralarida ko'p ifodalangan va o'ziga xos domen arxitekturasiga ega, shu jumladan signal peptidlari, transmembranli domenlar va fosfataza domenlari (3b -rasm). Kelgusi tadqiqotlar ushbu molekulalarning bir qismini CD yangi antijenlari, sitokinlari va kimyokinlari sifatida aniqlashi mumkin. Qizig'i shundaki, biz RefSeq proteinlar bazasidan (71 -versiya) o'chirilgan uchta oqsilni aniqladik: NP_003917.1, NP_059120.2 va NP_115949.3 (3a -rasmda qizil rangda ko'rsatilgan mos keladigan gen belgilari). Bu oqsillar oqsil dalillari, transkript dalillari yoki ikkalasi ham etarli emasligi sababli olib tashlandi. Uchala holatda ham biz mRNKni, shuningdek ularning transkripsiyasi va tarjimasini qo'llab -quvvatlovchi oqsilli dalillarni topdik. Kelgusida, nashr etilgan tadqiqotlarning transkriptomik va proteomik dalillarini birlashtirish orqali bunday noto'g'ri negativlardan (ya'ni dalil yo'qligi uchun bostiriladigan izohlardan) qochish mumkin.

Ko'p omilli ma'lumotlar to'plamini birlashtirish

Bir xil fondan olingan genomli ko'p o'lchovli ma'lumotlar majmuasining vertikal integratsiyasi bizga 1) genom ketma-ketligi va metilasyon kabi epigenetik modifikatsiyani hujayralardagi RNK va oqsillar ekspresiyasini qanday tartibga solishini 2) transkripsiyadan keyingi modifikatsiyaning hajmini o'rganish imkoniyatini berdi. Oddiy fiziologik sharoitda hujayralarda RNKni tahrir qilish 3) allelga xos va izoformga xos ifoda naqshlarini ko'rsatadigan genlar va 4) miRNKning ifoda naqshlari va ularning oqsil maqsadlarini ifodalashga potentsial ta'siri. Biz genomdan proteomgacha bo'lgan ma'lumotlarni to'plaganimiz uchun, shuningdek, inson genomida yangi oqsillarni kodlash hududlarini ochish imkoniyatini o'rganishimiz mumkin edi.

Allelning o'ziga xos ifodasi va RNK tahriri

Tozalangan bitta hujayrali genom va transkriptomlarning ketma-ketligi haqidagi ma'lumotlarni birlashtirib, biz allellarga xos ifoda va RNKni tartibga solish hodisalarini tekshirishga muvaffaq bo'ldik. Allelning o'ziga xos ifoda naqshlari bo'yicha xulosalar chiqarish uchun ikkita allelni ajratuvchi ketma -ketlik variantlari zarur bo'lganligi sababli, biz oldingi yondashuvlarga muvofiq heterozigotli SNPlarni o'z ichiga olgan barcha genlarni tadqiq qildik [19, 20]. Bu genlarning ko'pligi 84 ta genni aniqladi, bunda faqat bitta allel aniqlanadigan ifoda darajasini ko'rsatdi. Ikkala allel ham aniqlangan genlar uchun biz allelga xos ifodani kamida 10 o'qish xaritada bo'lgan va allellar o'rtasida o'qilgan o'qishda kamida 5 barobar farq bo'lgan holatlar sifatida aniqladik. Ushbu mezonlardan foydalanib, biz 103 genni aniqladik, bunda bitta allel asosan ifodalangan. Bunga ma'lum bosilgan genlar kiradi ATP10A va SNRPN ko'plab qo'shimcha oqsil kodlovchi genlar, psevdogenlar va kodlanmagan RNKlar bilan bir qatorda ilgari bosilmagan.

RNKni tartibga solish-bu post-transkripsiya mexanizmi bo'lib, uning yordamida RNK nukleotidlarining fermentativ deamidatsiyasi kodon-antikodon juftligini o'zgartirishga olib keladi. Keyingi avlod ketma -ketligida, bu o'zgarishlar pirovardida adenozinga guaninga yoki sitozinga timinga o'tishda qayd etiladi. Bu o'zgarishlar miRNA bilan bog'lanishdan oqsil funktsiyasiga qadar bo'lgan biologik jarayonlarga ta'sir qilishi mumkin. Bugungi kunga qadar, RNKni tahrir qilish bitta, tozalangan holda o'rganilmagan asosiy hujayra turi, garchi u o'lmas hujayra liniyalari va to'qimalarda baholangan bo'lsa -da [21-23]. Soddalashtirilgan CD4+ T hujayralarida RNKni tartibga solish saytlarini aniqlash uchun biz 4a -rasmda tasvirlangan quvur liniyasini ishlab chiqdik (batafsilroq ish oqimi 11 -qo'shimcha faylda ko'rsatilgan: S5 -rasm). Moslashtirilgan RNK-Seq ma'lumotlarini tahlil qilish, RNKni tartibga solishning 9877 ta potentsial saytini (RNK DNK Differentsiyasi yoki RDD deb ataladi) aniqladi, ularning 93 % butun genom ketma-ketligida topilgan SNPga to'g'ri keladi. Keyinchalik ketma -ketlikni o'z ichiga olgan RDD BLAST yoki BLAT yordamida tekislandi, bu RDDlarning yana 3 % ni hizalanish xatosi sifatida aniqladi, bu ko'pincha psevdogenlarni o'z ichiga oladi. Bu noto'g'ri pozitivlarni olib tashlash natijasida 333 ta potentsial RNKni tahrir qilish saytlari qoldi. Bu saytlarni tekshirish uchun 94 ta saytda DNK va RNKni maqsadli boyitish va qayta sekansirovka qilish amalga oshirildi. 22 ta sayt DNKni qayta tartiblash orqali bizning dastlabki WGS tomonidan chaqirilmagan SNPlar deb topildi. Qolgan 72 ta tasdiqlangan saytlardan 38 tasi RDD sifatida qayta kashf qilindi. Qolgan 34 ta saytlar qayta kashf qilinmagan bo'lsa, bizning maqsadli ketma -ketlik ma'lumotlarida tahrirlangan baza sezilarli darajada topilmadi (34 tasida taxminiy RDDni qo'llab -quvvatlaydigan 0, 1 yoki 2 o'qish bor edi), demak, dastlabki tahrir ketma -ketlik bo'lishi mumkin. xato Tasdiqlangan saytlar asosan ma'lum, kanonik tartibga solish saytlaridan iborat edi (A-to-G va C-to-T) (4b-rasm). Tasdiqlangan saytlarning funktsional ta'sirini aniqlash uchun biz ularning oqsillarni kodlaydigan hududlarda yoki kodlanmagan (ya'ni, kodlanmagan yoki oqsil kodlangan hududlarning tarjima qilinmagan hududlari) hududlarida topilganligini aniqladik. 4c-rasmda ko'rsatilgandek, ko'pchilik tahrirlar transkriptlarning kodlanmagan hududlarida sodir bo'lgan va oqsillarni kodlash hududlariga unchalik aniq ta'sir ko'rsatmagan, bu yaqinda o'tkazilgan tadqiqotga mos keladi [24]. Qizig'i shundaki, miRNKning bog'lanishini o'rganayotganda, biz 28 miRNK urug 'ketma -ketligi RNKni tahrir qilish orqali o'zgartirilganligini va 25 ta yangi saytni tahrir qilish orqali yaratilganligini aniqladik, bu esa RNKni tartibga solish uchun mumkin bo'lgan rolni ko'rsatishi mumkin.

Ish oqimi va sodda CD4+ T hujayralarida kuzatiladigan RNKni tartibga solish hodisalarining xulosasi. a Ish oqimi, sodda CD4+ T hujayra transkriptomida RNKni tahrir qiladigan saytlarni aniqlash uchun ishlatilgan. Y-o'qida RNKni tahrir qiladigan saytlar soni ko'rsatilgan va ularni diskvalifikatsiya qilish sabablari x o'qida ko'rsatilgan. b Tasdiqlangan RNK saytlarida kuzatilgan barcha nukleotidlarning o'rnini bosuvchi matritsa. Qizil rang bilan ajratilgan raqamlar kanonik o'zgarishlarni bildiradi (A-to-G va C-to-T). G-to-A va T-to-C ham ta'kidlangan, chunki bu o'zgarishlar RNK-Seq ma'lumotlarining noto'g'ri tayinlanishi bilan kanonik tahrirlar bo'lishi mumkin. Raqamlar ta'kidlangan yashil kanonik bo'lmagan hodisalardir. v RNKni tahrir qiladigan saytlarni transkriptlar ichida joylashishiga qarab taqsimlash

Ko'p omikli ma'lumotlarni birlashtirish orqali protogenomik tahlil

Yuqori qamrovli genomik, transkriptomik va proteomik ma'lumotlarning mavjudligi bizga yangi protein xususiyatlarini izohlashga hamda mavjud izohlarni takomillashtirishga imkon berdi [25]. Qo'shimcha 12 -fayl: S6 -rasmda ko'rsatilgan proteogenomik quvurimiz yordamida biz butun genom sekansirovkasi orqali aniqlangan genomik variantlarni o'z ichiga olgan maxsus peptid/oqsil ketma -ketligi ma'lumotlar bazalariga qarshi tengsiz tandemli ommaviy spektrlarni qidirdik. Bundan tashqari, biz 19-sonli inson genomining 6-ramkali tarjimasidan va RNK-Seq mos yozuvlar izohimizning 3-kadrli tarjimasidan (mRNK, nR-RNK, lncRNK va psevdogenlardan tashkil topgan) iborat bo'lgan maxsus protein ma'lumotlar bazalarini yaratdik. Bizning proteom ma'lumotlar bazamizda biz ma'lum ekzon birikmalarini o'z ichiga olgan 10 000 ta peptidni aniqladik va 17 ta peptidni aniqladik, ularning hammasi RNK-Seq ma'lumotlaridan aniqlangan 11 ta yangi ekzonlarning kodlash salohiyatini isbotlaydi. RNK-Seq yordamida aniqlangan FXR1 ning yangi izoformining misoli, shuningdek proteomik ma'lumotlar 5-rasmda ko'rsatilgan. Shuningdek, biz ma'lum mRNKlarning tarjima qilinmagan hududlarida aniqlangan 2 ta peptidga asoslangan 2 ta potentsial yuqori oqimdagi ORFni aniqladik (Qo'shimcha fayl 13: S7-jadval) ). Yangi tarjima saytlarini tavsiflash va kashf qilish uchun biz oqsillarning N-terminalli asetillanishini qidirdik. Biz 1,740 N-terminalli atsetillangan peptidlarni aniqladik, ular 1720 genli mahsulotlar uchun tarjimani boshlash joylarining mavjud izohlarini tasdiqlaydi. Muqobil boshlang'ich saytlarni topish uchun, ma'lum bo'lgan translyatsion boshlang'ich saytlarning yuqori va quyi oqimlarida metionin qoldiqlarini o'z ichiga olgan ma'lumotlar bazasi yaratildi. Shundan kelib chiqib, tarjima boshlang'ichlari ilgari noma'lum bo'lgan joylarni eksperimental qo'llab-quvvatlaydigan, hozirgi vaqtda izohlangan oqsil ketma-ketligi quyi oqimida 20 ta alternativ N-termini atsetillangan peptidlar aniqlandi.

Proteogenomika yangi oqsillarni kodlash hududlarini aniqlashga yordam beradi. Proteogenomika tomonidan aniqlangan peptid FXR1 gen. Peptidning MS/MS spektrlari va yangi izoformni qo'llab-quvvatlaydigan RNK-Seq ma'lumotlaridan o'qish zichligi tasvirlangan.

Signal peptidlari oqsillarning hujayra ichidagi yoki tashqarisidagi ma'lum joylarga translokatsiyadan keyingi translokatsiyasining ajralmas qismi hisoblanadi. Hozirgi vaqtda ma'lumotlar bazasini qidirishga asoslangan algoritmlar bo'linish joylarini muvaffaqiyatli bashorat qila olmaydilar va signal peptidlarini aniqlay olmaydilar, chunki kutilmagan tripsin bilan ajratilgan aminokislotalar signallarining ketma-ketligini aniqlashda qiyinchiliklar mavjud [26]. Ushbu qiyinchilikni engish uchun biz SMART [27], SignalP4.0 [28] va HPRD [29] da izohlangan bo'linish joylari bo'yicha taxmin qilingan signal ketma -ketliklari asosida bo'linish joylari oldidan triptik peptidlarni tahlil quvurimizga qo'shdik. Biz 35 ta ma'lum va 24 ta yangi signal peptidlarini ajratish joylarini aniqladik (Qo'shimcha fayl 14: S8 -jadval). Tarjima qilingan psevdogen ma'lumotlar bazasiga qarshi olib borgan qidiruvimiz, 3 ta psevdogenga xos bo'lgan 3 ta peptidni aniqladi (Qo'shimcha fayl 15: S9 -jadval), bu aslida oqsillarni kodlovchi yangi genlar. Bu topilmalar shuni ko'rsatadiki, uyali proteomni yuqori aniqlikdagi mass-spektrometriya ma'lumotlari bilan yuqori darajada qamrab olish, genom izohini ko'paytira oladigan, genomdan proteomgacha bo'lgan axborot oqimini tizimli o'rganishga imkon beradi.

CD4+ T hujayralarida oqsil va transkript ko'pligi o'rtasidagi bog'liqlikni o'rganish uchun biz oqsillarning iBAQ qiymatlari va FPKM transkript qiymatlarini o'zaro bog'ladik. Spearmanning FPKM va iBAQ qiymatlari orasidagi 0,35 korrelyatsiyasi topildi, bu transkript va oqsillar ko'pligi o'rtasidagi yomon korrelyatsiyani ko'rsatadi (Qo'shimcha fayl 16: S7 -rasm). MiRNA -larning sodda CD4+ T hujayralarida ifodalangan genlarni transkripsiyaviy yoki translyatsion repressiyadagi rolini o'rganish uchun miRNK miqdori aniqlandi va iBAQ va FPKM qiymatlari bilan solishtirildi. Global nuqtai nazardan, miRNKlarning potentsial maqsadlari bo'lgan genlarning oqsillari va transkriptlar ko'pligini ko'rib chiqishda, biz miRNA o'qish sonining ko'payishi bilan maqsadli genlarning o'rtacha oqsil darajasida doimiy pasayish borligini aniqladik (Qo'shimcha fayl 17: S8A -rasm) . Biroq, transkript darajasida bu tendentsiya unchalik sezilmadi (17 -qo'shimcha fayl: S8B -rasm).

DNK metilatsiyasining shakllari va ularning RNK va oqsil ekspresiyasiga ta'siri

DNKning metillanishi gen ekspresiyasining eng taniqli tartibga solish mexanizmlaridan biri bo'lib, metilatsiyaning ko'payishi ko'pincha transkripsiya faolligining pasayishiga to'g'ri keladi. Bu erda biz Illumina 450 K BeadChip massividan foydalanib, genom bo'ylab metilatsiyalash modellarini tahlil qildik. Global metilasyon profili bimodal taqsimotni ko'rsatdi, uning 39 % gipometilatsiyani (beta qiymati & 0.33) va 52 % gipermetilatsiyani (beta qiymati & gt 0.66) ko'rsatdi. Targ'ibotchi hududlarda (transkripsiyaning boshlanish joyining (TSS) yuqorisida 0–1500 tayanch sifatida aniqlanadi), saytlarning 69 % gipometilatsiyalangan, 23 % gipermetillangan. Umuman olganda, metillanish darajasi TSS yaqinida pastroq bo'lgan va gen tanasi va 3 ′ UTR orqali ko'tarilgan (Qo'shimcha fayl 18: S9 -rasm).

Metillanish darajasi yaqin transkript va oqsil darajalari bilan solishtirildi (mos ravishda transkript va oqsillar uchun o'lchov sifatida FPKM va iBAQ yordamida). Bu shuni ko'rsatdiki, targ'ibotchi hududlarning metillanishi mos keladigan genlarning past transkripsiya darajalari bilan zaif korrelyatsiyani ko'rsatdi (Qo'shimcha fayl 19: Rasmlar S10A va S10B). Protein ko'pligi va promoter metilatsiyasi (19 -qo'shimcha fayl: S10C -rasm) yoki turli genli hududlarning metilatsiyasi (19 -qo'shimcha fayl: S10D -rasm) o'rtasida hech qanday bog'liqlik kuzatilmadi. Biz bu erda topilgan metillanish va oqsil darajalari o'rtasida bog'liqlik yo'qligini faraz qilamiz, bu bizning global tahlilimizga bog'liq. Hamma genlar ham metillanish bilan tartibga solinmaganligi va transkripsiya va oqsil darajalari o'rtasida past korrelyatsiya mavjudligi sababli, metillanish darajasiga to'g'ri keladigan oqsil darajasining haqiqiy signali yashiringan deb hisoblaymiz. Buni tuzatish uchun biz metilatsiyaning funktsiyasi sifatida oqsillar tarkibidagi o'zgarishlarni aniqlash uchun qo'shimcha tajriba ishlari bilan birgalikda ma'lumotlarning to'g'ri tabaqalanishi zarur deb hisoblaymiz.

CD4+ T hujayralari antijenli tajribali xotirali CD4+ T hujayralari bilan ko'p omik taqqoslash.

T hujayralari differentsiatsiyasining epigenetik regulyatsiyasi

Naif CD4+ T hujayralari antijenni boshdan kechirgandan so'ng, CD4+ yordamchi T hujayralarining bir nechta avlodlariga bo'linadi - bitta avlod xotirada joylashgan CD4+ T hujayralari. Tinchlanadigan xotira CD4+ T hujayralari sodda CD4+ T hujayralarining antigen ta'siridan kelib chiqqan molekulyar o'zgarishlarni o'z ichiga oladi. Ushbu o'tishni tartibga soluvchi asosiy molekulyar mexanizmlarni ajratish uchun biz bu ikki yaqin hujayrali populyatsiyaning ko'p omikli qiyosiy tahlilini o'tkazdik. Targ'ibotchining metilatsiyaga bog'liq tartibga solish mexanizmlarini aniqlash uchun biz ikkala hujayra turidan metilom va transkriptom ma'lumotlarini kesib o'tdik va gen ekspressiyasiga ta'sir etishi mumkin bo'lgan differentsial metilasyon naqshlarini ko'rsatadigan genlarni topdik. LYN va SGK1 kinazalari, shuningdek metil-transferaza/gidrolazalar METTL7A va DDAH2 ning targ'ibotchi hududlari xotiraning T-hujayralariga nisbatan sodda CD4+ T hujayralarida gen ekspresyoni darajasining bir vaqtda oshishi bilan gipometilatsiyalangan (Qo'shimcha fayl 20: S11-rasm). Aksincha, CD4+ T hujayralari migratsiyasi uchun muhim bo'lgan CCR6 va chemokine CCL5 ning promoter hududlari gipermetillangan. Bu genlarning sodda CD4+ T hujayralarida ifodalanish darajasining pasayishi bilan bir qatorda, bu natijalar shuni ko'rsatadiki, sodda CD4+ T hujayralaridan xotirjam xotira T hujayralariga o'tishda metilasyon va gen ekspresiyasida o'ziga xos molekulyar o'zgarishlar mavjud bo'lib, ular oldingi kuzatuvlarga mos keladi. 30-32].

Keyin biz ma'lumotlar bazamizda metilatlangan saytlarning targ'ibotchilari bo'lmagan rolini o'rganib chiqdik. Potentsial tartibga soluvchi DNK metillanish joylari TCGA ma'lumotlar to'plamidagi yuzlab o'smalardagi DNK metilatsiyasi va gen ekspresyoni modellarini solishtirish va teskari metilatsiyaga va genlar ekspresiyasi korrelyatsiyasiga ega saytlarni tanlash orqali aniqlandi (TCGA, https://tcga-data.nci.nih.gov/) tcga/) [33, 34]. TCGA ma'lumotlar majmuasidan aniqlangan har bir tartibga soluvchi sayt uchun biz DNK metilatsiyasidagi va sodda CD4+ T hujayralari va xotira T hujayralari o'rtasidagi gen ekspresiyasidagi farqlarni tekshirdik (Qo'shimcha fayl 21: S10 -jadval). Bu yondashuv bizga CD4+ T hujayralari biologiyasi bilan bog'liq DNK metilasyon joylari, genlari va yo'llarini boyitishga imkon berdi (Qo'shimcha fayl 22: Jadval S11). Masalan, TCR yo'lida, T hujayralarini faollashtirish uchun juda muhim bo'lgan ko'p genlar tartibga solish joylarida yuqori darajada metillangan bo'lib, xotira hujayralariga nisbatan sodda hujayralardagi ifoda darajalari pasaygan. Bu T hujayralarini farqlash uchun zarur bo'lgan bu muhim yo'lni epigenetik tartibga solishni taklif qiladi.

Naif va xotira T hujayralari o'rtasidagi protomik va fosfoproteomik farqlar

Soddalashtirilgan CD4+ T hujayralari va CD4+ T xotira hujayralari o'rtasidagi signal farqlarini o'rganish uchun biz solishtirma proteomik va fosfoproteomik yondashuvlardan foydalanganmiz. Namunalar orasidagi oqsillar miqdorini o'lchaydigan iTRAQ [35] metodologiyasi yordamida miqdoriy proteomika amalga oshirildi. Bundan tashqari, biz TiO yordamida har ikkala turdagi fosfopetidlarni boyitdik2strategiyaga asoslangan va ionlarning ko'pligiga asoslangan ularning farqlarini miqdoriy jihatdan aniqlagan [27, 36]. 6a -rasmda ko'rsatilgandek, bir nechta oqsillar sodda va xotirjam xotira T hujayralari o'rtasida farqli ravishda ifodalanganligi aniqlandi. Qizig'i shundaki, ko'plab oqsillar oqsil ko'pligida hech qanday o'zgarishsiz, ikkita hujayra turi o'rtasida differentsial fosforillanish darajasini ko'rsatgan. Differentsial fosforillangan oqsillarning ko'zga ko'ringan misollari, ikkita hujayra turi o'rtasida teskari fosforillanish modelini ko'rsatgan, yomon tavsiflangan ikkita kinaz, SGK223 va BAZ1B ni o'z ichiga oladi (6b -rasm). SGK223 sodda CD4+ T hujayralarida yuqori protein va fosforillanish darajasini ko'rsatdi, shu jumladan Ser508 va Ser805. Xotira hujayralari T hujayralarini faollashtirishda muhim rol o'ynaydigan kinazlarning yuqori oqsil darajasini ifodalaydi, jumladan LYN, SYK, BTK va TBK1. Xotira hujayralarida bu kinazalarning yuqori darajada ifodalanishi, xotira hujayralariga antigen ta'sir qilish signalizatsiya molekulalarining yuqori darajasiga ega bo'lganligi sababli kuchli va tezroq immunitetli javob berishga olib keladi degan tushunchaga mos keladi. Bizning proteomik tahlilimiz, shuningdek, T hujayrali signalizatsiyasida yaxshi o'rganilgan adapter oqsillarining fosforlanishini ko'rsatdi. Masalan, kaspazani ishga soluvchi domen o'z ichiga olgan oqsil 11 (CARD11)-bu T-hujayralari faollashuvi paytida NF-kB faollashuviga vositachilik qilish uchun mas'ul bo'lgan ko'p domenli iskala molekulasi [39, 40]. Ser552, Ser564 va Ser657 ning fosforillanishi CARD11 da CARD11 vositachiligida NF-kB aktivatsiyasini qo'zg'atishi ma'lum, Ser649 ning fosforillanishi esa NF-kB aktivatsiyasini pasaytiradi [41, 42]. Ammo, eng qiziqarlisi, oqsillar bo'lib, ular namunalar o'rtasida farqlanmagan, biroq fosforlangan. Yaqinda kashf etilgan tirozin kinaza BAZ1B, ikkala hujayra turida ham bir xil protein darajasini ko'rsatdi, lekin xotira hujayralarida fosforillanish darajasi oshdi. NF-kB faollashuvini tartibga soluvchi CARD11-BCL10-MALT1 kompleksining asosiy komponenti BCL10da oltita differentsial fosforlangan joylar aniqlandi [43, 44]. Ser121, T130, S134, S136, Ser141 va ilgari ma'lum bo'lgan Ser138 yangi saytlari xotirada CD4+ T hujayralarida yuqori darajada fosforlangan. Ser138 NF-kB faollashuvini salbiy tartibga soladi va shu sababli sodda hujayralarda bu saytning fosforillanishining oshishi NF-kB faollashuvi cheklangan antigen tajribasizligiga mos keladi [45].

Soddalashtirilgan CD4+ T hujayralari va xotira T hujayralari o'rtasida differentsial metilasyon, gen/oqsil ekspresiyasi va fosforillanish sxemasi. a Naif va xotira CD4+ T hujayralari o'rtasida oqsillarning differentsial ifodasi va fosforillanish sxemasi. The qora ma'lumotlar nuqtalari qizil va ko'k chiziqlar sodda va xotira T hujayralarida fosforlanishning nisbiy darajasini ko'rsatadi, sodda va xotira T hujayralari orasidagi oqsillarning nisbiy ifodalanish darajasini ko'rsatadi. b Kinazlar, fosfatazalar, proteazalar, transkripsiya omillari va signalizatsiya molekulalariga misollar, ularning ekspressivlik darajasi va/yoki fosforillanish darajasida naif va xotira T hujayralari o'rtasida sezilarli farq ko'rsatdi. Vertikal va gorizontal tasvirlar oqsillarni, doiralar esa fosforlanish joylarini ifodalaydi. Xotira hujayralaridagi yuqori darajalar ko'k rangda, pastki darajalarda ko'rsatilgan qizil o'zgarmagan mo'llik bilan belgilanadi kul rang

T hujayralari faollashganda, kaspaz-3 tomonidan proteolitik bo'linish pro-IL16 ni hujayra migratsiyasini rag'batlantiruvchi proinflamatuar xemoatraktant IL16 ga aylantiradi [46, 47]. IL16 pro-IL16 prekursori-bu yadroli va sitoplazmatik iskala oqsilidir, u hujayralar tsiklini to'xtatishda ishtirok etadi, shu jumladan T-hujayralardagi HDAC va ion kanallari [48]. Bizning tadqiqotimizda pro-IL16 oqsillarini ifoda etish darajasi sodda va xotira CD4+ T hujayralari bilan solishtirish mumkin edi. Biroq, fosforillanish naqshlari bir -biri bilan chambarchas bog'liq bo'lgan ikkita hujayradan farq qilgan. Biz 16 fosforillanish joyini aniqladik, ulardan 10 tasi IL16 pro-da. Qizig'i shundaki, 16 ta saytning 6 tasi sodda CD4+ T hujayralarida yuqori darajada fosforlangan, Thr1058 esa xotira hujayralarida yuqori darajada fosforlangan. Bu topilmalar sodda va xotira CD4+ T hujayralarida IL16 pro-ning turli rollariga parallel. Kantitativ proteomik va fosfoproteomik ma'lumotlarni birgalikda tahlil qilish orqali biz T hujayralari biologiyasini o'rgana oldik va bu ikki hujayra fenotipini fosforillanish vositasida tartibga solish haqida yangi tushunchalarga ega bo'ldik. Bu topilmalar birgalikda yangi kinazalar uchun faol rolni ko'rsatadi va T hujayralarini faollashtirishda hal qiluvchi bo'lishi mumkin bo'lgan signalizatsiya hodisalarini ochib beradi.

Metilom, transkriptom, proteom va fosfoproteomdan ma'lumotlarni birlashtirib, biz sodda va xotira T hujayralarini tartibga soluvchi molekulyar hodisalarning keng qamrovli ko'rinishini oldik (7 -rasm). Integratsiyalashgan yo'lning foydaliligini baholash uchun biz immunitet funktsiyasi nuqtai nazaridan bir nechta asosiy signalizatsiya molekulalarini baholadik. Ikkala hujayra populyatsiyasi ham dam olish holatida ekanligini hisobga olsak, TCR yo'lida asosiy oqim kinaz LCK ham protein, ham fosforillanish darajasida o'zgarmaydi. Biroq, CD4, ITK va AKT1 sodda CD4+ T hujayralarida gipermetillangan bo'lib, transkript va oqsil darajasining pasayishi kuzatildi. Protein tirozin fosfatazasi, retseptorlari turi, C (PTPRC, shuningdek CD45 deb ham ataladi) va KRAS bu naqshdan ikkita muhim istisno edi. KRASning yuqori darajadagi oqsillari yaqinda T hujayralarida TCR-faollashuv chegarasini pasaytirishda ishtirok etdi [49]. Bu erda biz xotira hujayralarida KRASning gipometilatsiyasini va yuqori transkript va oqsil darajasini topdik. Bundan farqli o'laroq, sodda hujayralarda KRAS gipermetillangan va transkripsiya darajasining pastligi, TCR faollashuvining yuqori chegarasiga mos keladi. Birlashtirilgan holda, ushbu integratsiyalashgan yondashuvning kuzatuvlari TCR yo'li haqida ma'lum bo'lgan ma'lumotlarga mos keladi, bu ko'p qirrali ma'lumotlar to'plamining keng molekulyar tushunchalarga ega bo'lish kuchini namoyish etadi.

T -hujayrali retseptorlari signalizatsiya yo'li, DNK metilatsiyasi, gen/oqsil ekspresiyasi va/yoki oqsil fosforillanishi bilan tartibga solinadigan pastdagi mediatorlarni ko'rsatadi. T -hujayrali retseptorlari signalizatsiya yo'li, ularga mos keladigan targ'ibotchining metilatsiyalanish holati, gen va oqsil ifoda darajasi va sodda va xotira T -hujayralari orasidagi fosforlanish holati tasvirlangan. Promoter metilatsiyasining holati, transkriptomik, proteomik va fosfoproteomik o'lchovlar GeneSpring -ga olib kelingan va sodda CD4+ T hujayralaridan CD4+ T hujayralariga xotiraga o'tishning molekulyar imzolarini aniqlash uchun TCR signalizatsiya yo'liga yotqizilgan. Turli xil shakllar promotor metilatsiyasini, mRNK, oqsil va fosforillanish holatini ko'rsatish uchun ishlatiladi. Qizil sodda CD4+ T hujayralari yuqori ekanligini ko'rsatadi, ko'k CD4+ T hujayralari xotirada yuqori ekanligini ko'rsatadi va o'zgarmagan holda tasvirlangan oq. Turli xil rangli o'qlar yo'l komponentlarini tartibga solishning turli usullarini tasvirlash uchun ishlatiladi

Boshqa ma'lumotlar to'plamlari bilan integratsiya

Nihoyat, biz ma'lumotimizni baholamoqchi bo'ldik, yaqinda chop etilgan sodda va xotirali CD4+ T hujayralari bo'yicha tadqiqotlar, muvofiqlikni tekshirish va ma'lumotlarimiz qanday qilib mavjud ma'lumotlar to'plamini to'ldirishini o'rganish uchun.

CD4+ T hujayralarining soddaligi va xotirasida metilatsiya va transkripsiya o'rtasidagi bog'liqlikni o'rganish, Komori va boshqalar. 2100 genning RNK-sek va maqsadli bisulfit sekansidan foydalanilgan. Ular sodda va xotira CD4+ T hujayralari o'rtasida differentsial metilatsiyaga ega bo'lgan 132 gen haqida xabar berishdi. Bu 132 genning 39 tasi metilatsiyaning pasayishini ko'rsatdi, shu bilan birga sodda va xotira hujayralarida transkript ko'pligi oshdi. Afsuski, bu 40 ta gen uchun metilatsiyaning miqdoriy qiymatlari mavjud edi, shuning uchun biz tahlil qilish uchun ularning 132 genlari uchun "oshgan, o'zgarmagan va kamaygan" metilatsiyasini 1, 0 va -1 ga moslashtirdik. bizning tahlilimiz. Ikkala tadqiqotda metillanish darajasini solishtirganda, biz Pirson korrelyatsiyasini 0,42 ga tengligini kuzatdik (Qo'shimcha fayl 23: S12A -rasm). Bu korrelyatsiya 0.61 ga ko'tarildi, faqat metillanish qiymatlari mavjud bo'lgan 40 ta gen (solishtirma fayl 23: rasm S12B).

Keyinchalik, metillanish darajasi qo'shni genlardan olingan transkriptlar ifodasi bilan qanchalik yaxshi bog'liqligini baholadik. Buning uchun biz CD4+ T hujayralari va faol bo'lmagan sodda CD4+ T hujayralari va metilasyon va transkripsiya o'rtasida teskari bog'liqlik ko'rsatgan tanlangan genlar bilan taqqosladik. Garchi Komori va boshqalar. metillanish darajasi va bu genlarning transkripsiyasi o'rtasidagi teskari bog'liqlikni tasvirlab berdik, biz ma'lumotimizda shunga o'xshash umumiy tendentsiyani kuzatmaganmiz (Qo'shimcha fayl 23: S12C -rasm). Buning har bir tadqiqot o'rtasidagi transkript darajasidagi global farqlar tufayli bo'lganligini aniqlash uchun biz RPKM qiymatlarini solishtirdik Komori va boshqalar. bizning tadqiqotimizdan FPKM qiymatlari bilan. Biz Pearson korrelyatsiya koeffitsienti 0,58 ni aniqladik, bu har bir eksperiment o'rtasidagi transkript darajasini bir xil darajada mosligini ko'rsatdi (Qo'shimcha fayl 23: S12D -rasm). Bu aniq farqlarni bartaraf etish uchun qo'shimcha tajribalar talab qilinadi.

Tomonidan yaqinda nashr etilgan Graessel va boshqalar. sodda va faollashtirilgan CD4+ T hujayralarining hujayrali sirt oqsillari 173 hujayrali sirt oqsillarini mass-spektrometriya yordamida aniqlash uchun N-glikozillangan sirt oqsillariga yo'naltirilgan boyitish strategiyasidan foydalangan. Bu qo'shimcha 123 hujayra sirt oqsillarini aniqlash uchun oqim sitometriyasi bilan to'ldirilgan, sodda va faollashtirilgan CD4+ T hujayralari yuzasida ifodalangan 229 ta oqsil. Tadqiqotimizda sodda CD4+ T hujayralari proteomik profillanishi tufayli biz bir -birini to'ldirishga harakat qildik Graessel va boshqalar.Ning sirt atlas. Bundan tashqari, biz sodda va xotirjam xotira CD4+ T hujayralarini qiyosiy tahlilini o'tkazganimiz sababli, sodda CD4+ T hujayralari faollashuvi paytida qanday o'zgarishlar vaqtinchalik bo'lishi mumkinligini va qaysi oqsil o'zgarishi xotiraning xotirasida qolishini aniqlashni xohladik.

Birinchidan, kengaytirish uchun Graessel va boshqalar.Ning sirt atlasi, biz o'z tadqiqotimiz natijasida oqsillarni UniProtKB/Swiss-Prot ma'lumotlar bazalarida "membrana" yoki "ajratilgan" izohlangan oqsillarni saqlashning bioinformatik strategiyasidan foydalanib aniqladik. Ushbu tahlil ma'lumotlar bazamizda 1767 nomzod oqsillarni aniqladi. Konservativroq taxmin qilish uchun biz GO izohi bilan membrana yoki hujayradan tashqari izohlangan oqsillarni ushlab turishning qo'shimcha mezonini qo'lladik, natijada 1166 ta oqsil paydo bo'ldi. Xuddi shu filtrlarni biz ham qo'lladik Graessel va boshqalar.Ning proteomik ma'lumotlar va ushbu mezonlarga javob beradigan 146 ta oqsil topildi. Ma'lumotlar to'plamlari o'rtasida 104 ta hujayra yuzaki oqsillari bir -biriga to'g'ri keldi, faqat 42 ta oqsil mavjud Graessel va boshqalar. va 1062 oqsillar bizning ma'lumotlarimizga xosdir (Qo'shimcha fayl 24: S13A -rasm). Ehtimol, chuqurlikdagi nomutanosiblik Graessel va boshqalar. N-glikoproteinli oqsillarni boyitish strategiyasini qabul qilish, bizning tadqiqotimizda qo'llaniladigan global chuqur fraktsion usullardan farqli o'laroq.

Keyin biz o'lchagan o'zgarishlarni solishtirdik Graessel va boshqalar. aCD3/aCD28 yordamida sodda CD4+ T hujayralarini faollashtirishdan so'ng. Graessel va boshqalar. 24 soatlik faollashuvdan so'ng hujayra sirtining ekspresiyasi oshgan 108 ta oqsillar klasteri haqida xabar berdi. Ma'lumotlarimizda biz bu 108 ta oqsilning oqsil ifodasi o'rtacha CD4+ T hujayralari xotirasida ortganligini aniqladik (Qo'shimcha fayl 24: S13B -rasm). Bu genlarning ko'pchiligi odamlarning T hujayralari differentsiatsiyasi va ko'payishi (masalan, CD2 superfamily molekulalari, TNSFS14, CD147), energiya molekulalarini tashish (masalan, GLU3, SLC genlari), uyali yopishish va migratsiya (masalan, CD29, CD226) va CD74 (o'zgarmas zanjir) va HLA molekulalarini o'z ichiga olgan antijeni qayta ishlash va taqdim etish komponentlari.


Muhokama

Bermudagrass ildizlarida vaqtga xos tuzga tez javob berish modullari

O'simliklarning oldingi transkriptom tahlillari tuz stressining turli bosqichlarida differentsial javob strategiyasini ochib beradi [31, 32]. Masalan, o'simliklar osmolitlarning hujayra ichidagi kontsentratsiyasini oshirish orqali dastlabki osmotik stressga javob beradi. NaCl ta'siridan 24-72 soat o'tgach, Na + toksisitesini engillashtirish eng dolzarb vazifaga aylanadi [23, 24]. Dastlabki bosqichda bermudagrass ildizlarining tuz zarbasiga transkriptom tuzatishlarini o'rganish uchun, birinchi navbatda, tuz reaktsiyasini o'rganish uchun 1 soat tanlangan. Biz tuzni davolashdan keyin 1 soatdan 4 soatgacha soya birinchi osmotik stress bosqichiga duch kelganligini ko'rsatgan oldingi tadqiqotga asoslanib tuzga (1 soat) javob berilgandan so'ng, keyingi reaktsiyani o'rganish uchun 6 soatni davolash vaqti sifatida tanladik. [2]. Tuzga javob berish strategiyasi bermudagrassda o'zgara boshlaganligini tekshirish uchun 24 soat tanlangan, chunki 24 soat tuzni o'zgartirish strategiyasi ba'zi o'simliklarda o'zgarishi mumkin bo'lgan burilish nuqtasi bo'lishi mumkin [23, 24].

Bermudagrassda, tuzning ta'siriga har xil turkumdan olingan 2,4 va 6 barobar ko'proq o'ziga xos genlar, tuz ta'sirida 6 soat yoki 24 soat ta'sir qilganlarga qaraganda, 1 soat davomida ta'sirlangan ildizlarda farqli ravishda tartibga solingan, bu esa tezda javob berishni taklif qiladi. tuz ta'sir qilish (3 -rasm). Masalan, kinazalar kabi bir nechta signal retseptorlari (masalan, LRR, thaumatin-ga o'xshash, RLK1, DUF26, LLD, LRK10 kabi, PERK va WAK) 1 soat ichida darhol va faqat yuqoridan tartibga solinadi (S4a-rasm). Bu signal retseptorlari kinazalari har doim oqsil fosforillanishi va modifikatsiyasida ishlash uchun avvalgi vaqtda javob beradi, bu tuz javobining signalizatsiya yo'llarini boshlashda va oxir -oqibat transkripsiya regulyatsiyasiga olib keladigan muhim qadamdir [33,34,35,36,37]. Bundan tashqari, tuz signallari darhol gormonlarning quyi oqimlarini qo'zg'atishi mumkin, ular ma'lumki, ular stressli reaktsiyalarda keng doirada ishtirok etadilar [19, 38]. Ushbu tadqiqotda ABA biosintezi va signal uzatish sub-qutilari (17.1.1, 17.1.2, 17.1.3) bilan bog'liq bo'lgan genlar uch martalik nuqtalarda (masalan, NCED PP2C va ABFs) doimiy ravishda boyitilgan (5a-rasm). ), tuzning javob berishida belgilangan rolni taklif qiladi [9]. Shu bilan birga, biz biosintez va ETH (masalan, ACC sintaz ACC oksidaza va ERF) va JA (masalan, AOS1 va AOC4) signallarining uzatilishi bilan bog'liq bo'lgan transkriptlar faqat 1 soat tuz ta'sirida haddan tashqari ko'payib ketganini payqadik. 4a jadvali S2), bu tuzga javob beradigan gormonlar metabolizmining yo'llari bermudagrass ildizlarida tuzning tez javob berishida ishtirok etishi mumkinligini ko'rsatadi [32, 39, 40]. Bundan tashqari, CTK va GA degradatsiyasida ishtirok etadigan transkriptlarning induksiyasi sezildi (4a -jadval S2 -rasm). Gibberellinni parchalovchi ferment gibberellin 2-oksidazani (mos ravishda At4g21200 va At1g75450 gomologlari) kodlovchi transkriptlar hujayra o'sishi atrof-muhit tuzi ta'sirida omon qolish uchun qisman inhibe qilinganligini ko'rsatdi. AtCKX6 (At1g75450) gomologlarining kamida 9 ta transkriptining ifodasi tartibga solingan (S2 -jadval), u sitokinlarning degradatsiyasini katalizatsiyalashda ishtirok etuvchi sitokinin oksidaza/dehidrogenazani kodlaydi [41, 42]. Bu natijalar shuni ko'rsatdiki, gormon signalizatsiyasi tuz ta'siriga vositachilik qilishda yolg'iz ishlamaydi, lekin u boshqa gormonlar bilan o'zaro bog'liqlik tarmog'ida ishlashi mumkin.

Hujayra ichidagi fosforillanish hodisalari o'simliklardagi muhim sensorlar-transduserlari bo'lgan CDPKlar [9,10,11,12,13,14] va MAPK kaskadlari [43,44,45] kabi ikkinchi darajali xabarchilarning quyi oqimida bo'ladi. Ushbu tadqiqotda kaltsiy signalizatsiyasi bilan shug'ullanadigan ba'zi gen a'zolari tuz ta'siridan keyin 1 soat davomida javob berishdi (masalan, CDPK11, CAM3, CPK5 va CML43) (S4a jadvali S2). Kaltsiyni tashuvchi ATPazani kodlovchi ba'zi genlar 1 soat ichida haddan tashqari ko'payib ketgan, bu esa Ca 2+ ning transmembranali tashilishini yanada kuchaytirishi mumkin (S2-jadval). A MAPK2 At2g43790 gomologi bo'lgan gen (klaster-342,212.26954) ham faqat 1 soatda tartibga solingan (S2b-rasm) va tuz reaktsiyasida ROS va gormon bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin [46, 47]. Bu oqsil kinazalarini kodlovchi genlarni zudlik bilan tartibga solish tuzning stressli holatini engish uchun transkriptomning quyi oqimini qayta konfiguratsiyasini qo'zg'atishi mumkin [48].

Bermudagrassning ildizida biz tuz ta'siridan keyin bir yoki bir nechta vaqt nuqtalarida sezilarli darajada induktsiya qilingan o'ndan ortiq transkripsiya omillarini aniqladik (S5 -rasm). Induktsiya qilingan TF soni oxirgi vaqt nuqtalariga qaraganda 1 soatda ko'proq edi. Bu TFlar orasida AP2, WRKY, bHLH va HB oilalari aniqlangan tuzli TFlarning umumiy sonining katta qismini tashkil etdi va uchta oila (MYB, HB, bZip) har uch vaqt nuqtasida ham sezilarli darajada induksiya qilindi (5b-rasm). S2 -jadval). Ushbu tadqiqotda bitta HSF transkripsiya faktori brown4 qo'shma ekspression tarmog'ining markaz geni sifatida o'rganildi (6d-rasm). Bu HSF transkripsiya omilining ifodasi har uch vaqtda tuz bilan tartibga solinganligini ko'rsatdi va bu kelajakdagi tadqiqotlar uchun yaxshi maqsad bo'lishi mumkin (7f S7 rasm). WRKY TFs tuz toleransida ijobiy yoki salbiy ishtirok etishi mumkinligi haqidagi oldingi tadqiqotlarga muvofiq [49], shuningdek, 23 ta WRKY TF ning 20 tasi ildizlarda tuz bilan ishlov berishga javoban sezilarli darajada induktsiya qilinganini kuzatdik (S5 -jadval S2 -rasm). . AP2/EREBP oilasi, shuningdek, stressga javob beradigan TF [50] ni o'z ichiga olishi haqida xabar berilgan. Biz, shuningdek, 17 soatlik AP2 transkriptlarining 16 tasi 1 soat tuz bilan ishlov berilgandan so'ng tartibga solinganligini kuzatdik (S2-jadval). Tuz stressi ostida, ildizlardan boshqa ko'proq ta'sirlangan TF oilasi bHLH edi, 24 ta transkriptning 24 tasi 1 soatda induktsiya qilingan va 19 ning 10 tasi 6 soat ichida tuz stressidan oshgan (S2 -jadval). Ushbu bHLH TFlari orasida, ba'zi muhim a'zolar, bHLH92 [51] kabi tuzning stress ta'sirida ijobiy ishtirok etishi xabar qilingan. Aux/IAA oilalari tuzga sezgir transkriptlarda, ayniqsa 1 soat ichida, tuz stresi bilan tartibga solingan 12 ta transkript bilan sezilarli darajada boyitilgan (masalan, IAA5, 12, 20, 24, 18, 23) (S2-jadval). Bu tuz-javob Aux/IAA genlari auxin reaktsiyasida markaziy rol o'ynaydi va atrof-muhit stimullari signalini auxin bilan bog'liq genlarni tartibga solish tarmog'iga qo'shishga harakat qilishi mumkin [52]. Shuning uchun, biz bu erda, ba'zi bir biologik jarayonlar tuz stressining dastlabki bosqichida, asosan signal uzatish, gormonlar almashinuvi va TFlarni tartibga solishni o'z ichiga olganini payqadik. Bu tezkor javoblar, bir qator quyi oqim omillarini faollashtirish uchun kaskadni tashkil qilishi mumkin.

Bermudagrass ildizlarida tuzning umumiy va o'ziga xos ijobiy javob mexanizmlari

O'simliklar tuz kabi qattiq muhit tufayli ROSni zararsizlantirish uchun turli xil gen oilalarini ishlab chiqardi [19, 20]. Bizning tadqiqotimizda POD faolligi 1 soat va 6 soat tuz bilan ishlangan o'simliklarning ildizlarida, ularning tegishli nazorat ildizlariga qaraganda ancha yuqori bo'lgan (1b-rasm). Shu bilan birga, 1 soat va 6 soat tuz bilan ishlangan ildizlarning SOD faolligi yuqorilash tendentsiyasini ko'rsatdi, lekin o'sish ularning tegishli nazorat zavodlariga nisbatan sezilarli emas edi (1c-rasm). Shunga ko'ra, POD kodlovchi genlarning bir nechta a'zolari yuqori tartibga solingan, lekin transkriptom ma'lumotlarida SOD kodlovchi genlar yuqori darajada tartibga solinmagan (4-jadval S2-rasm). Oksidlanish stressi ROS keltirib chiqaradigan lipid peroksidlanishining (MDA bilan ko'rsatilgan) yomonlashuvining natijasi bo'lgani uchun, biz ildizlardagi MDA tarkibini ham o'lchadik. Shu bilan birga, MDA ildizlari 24 soat davomida tuz ta'siriga qadar nazorat qiluvchi o'simliklarga qaraganda yuqori qiymatni ko'rsatdi (1a -rasm), bu davolash vaqtining ko'payishi bilan progressiv to'planishni ko'rsatadi. Oksidaz-mis, glutatyon S transferazalarini, beta 1,3 glyukan gidrolazalarini, UDP glyukozil va glyukoronil transferazalarini, plastosiyaninga o'xshash oqsillarni (4-jadval S2-rasm) kodlaydigan genlar oilasining boshqa a'zolari ham bir yoki bir nechta vaqt nuqtalarida yuqori tartibga solingan. tuz stressini engish. Masalan, UDP glyukosil transferazalari UGT79B2/B3 in Arabidopsis tuz va qurg'oqchilik kabi abiotik stressga chidamliligiga antosiyanin to'planishiga ta'sir qilish va ROSni tozalashni kuchaytirish orqali hissa qo'shganligi xabar qilingan [53]. O'simliklardagi ilgari o'tkazilgan tadqiqotlarga muvofiq, bermudagrass ildizlaridagi ba'zi bioaktiv ikkilamchi metabolitlar (masalan, karotenoidlar, tokoferollar va flavonoidlar) [54,55,56] tuz ostida juda ko'p ifodalangan va ular ROS yig'uvchilar sifatida ham xizmat qilishi mumkin (4b-rasm). S2 -jadval). Kutilganidek, ushbu tadqiqotda osmoprotektorlarning darajasini tartibga soluvchi genlar ham yuqori darajada tartibga solingan. Ularga galaktinol sintazalarini, rafinoza sintazasini, trehalozani, kallozani va galaktozani kodlovchi genlar kiradi (S4d-rasm), ular tuz stressi ostida birinchi stress keltirib chiqaradigan genlar [23,24,25,26].

O'simliklar hujayra devori tsellyuloza, gemitsellüloza, lignin, pektin va ko'plab glikoproteinlardan iborat [57, 58] va tuz stressini sezish va ularga javob berishning muhim omili hisoblanadi. Biz, shuningdek, bermudagrassning tuz bilan ishlangan ildizlarida tsellyuloza sintaz (10.2), gemitsellüloz sintezi (10.3) va lignin sintezi (16.2.1) bilan shug'ullanadigan genlar haddan tashqari ko'p bo'lganini payqadik (4f-rasm). Glikozid gidrolaza (GH17) oilasi genlarining ekspresiyasi 1 soat tuz stressi ostida sezilarli darajada qo'zg'atildi (4-jadval S2-rasm), bu uning hujayra devori bilan bog'liq oqsillarning translyatsiyadan keyingi modifikatsiyasida ishtirok etishi va hujayraning o'zgarishiga olib kelishi mumkinligini ko'rsatadi. devorlarning egiluvchanligi [59, 60]. Bundan tashqari, hujayra devorining kengayish funktsiyasini bajaradigan boshqa hujayra devorlari bilan bog'liq genlar oilalari ham tuzga sezgir transkriptlarda differentsial regulyatsiyani ko'rsatdilar. Masalan, ifodasi MUR4 bermudagrass ildizlarida yuqori regulyatsiya qilinganligi aniqlangan (4f-rasm) va UDP-arabinozaning biosintezida ishlaganligi haqida xabar berilgan. Mutatsiya MUR4 hujayra devori yaxlitligiga ta'sir qiladi va yuqori sho'rlanish ostida ildiz cho'zilishining pasayishi bilan hujayra hujayralarining nuqsonli yopishishiga olib keladi [61]. Bundan tashqari, bizning tadqiqotimizda transkript darajasida tuz bilan tartibga solinadigan bir nechta AGPlar (arabinogalaktan oqsillari) topilgan (4f-rasm). Hujayra devorlari yoki plazma membranalaridagi AGPlar, shuningdek, hujayra o'sishi bilan bog'liq [62, 63] va bitta AGP (SOS5) tuzlarga chidamliligiga hissa qo'shganligi ma'lum qilingan. Arabdiopsis [64]. Biz yana bermudagrass ildizlarida lipid almashinuvining oldingi javobini payqadik. Xususan, FA sintezi va cho'zilishida ishtirok etuvchi genlarning ifodasi past darajada tartibga solingan, FA desaturatsiyasida va lipidlar degradatsiyasida ishtirok etuvchi genlar 1 soat tuz ta'sirida bo'lsa, darhol tartibga solinadi (S4b-rasm). Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, FA desaturazalari turli xil sharoitlarda, shu jumladan tuz stressida, o'simlik hujayralarida membranalarning biologik funktsiyasini saqlashda muhim rol o'ynaydi [65, 66]. Bu erda tuz stressi FA tarkibining o'zgarishiga olib kelishi mumkin bo'lgan D-3 FA desaturazalarini kodlovchi genlar ifodasini sezilarli darajada o'zgartirdi (S4b-rasm, S2-jadval). Lipit tarkibini rekombinatsiyalash uchun kodlovchi genlarni zudlik bilan tartibga solish, bermudagrassning tuzga chidamliligini yaxshilash uchun yangi tushuncha berishi mumkin.

Hujayra devori modifikatsiyasida sezilarli ishtirok etgan ikkilamchi metabolizm bilan bog'liq genlardan tashqari (4f-rasm), ba'zi muhim ikkilamchi metabolizm yo'llari uzoq vaqt davomida sezilarli darajada induksiya qilingan, bu metabolik sozlashni o'z ichiga oladigan biroz sekinroq reaktsiyalarni ko'rsatadi [67, 68]. Misol uchun, poliamin sintezining pastki qutisi faqat 6 soat va 24 soat tuz bilan ishlov berilgandan keyin haddan ziyod ko'paygan. Oddiy fenol, glyukozinolatlar, izoflavonlar va tokoferol biosintezi kabi ikkilamchi metabolizmga kiruvchi ba'zi sub-qutilar 24 soat ichida maxsus ravishda haddan tashqari ko'payib ketgan (4-rasm S2-jadval). Bu ikkilamchi metabolizmlar ilgari ba'zi turlarda o'simliklarning oksidlanish reaktsiyasida ishtirok etishi haqida xabar berilgan edi [67, 68]. Masalan, lakkas kodlovchi genlarning ifodasi, ayniqsa, 24 soat davomida tuz ta'sirida bo'lganida, tartibga solingan bo'lib, ular bermudagrass ildizlaridagi oddiy fenollarning oksidlanishida va kamayishida ishtirok etishi va tuz stressidan kelib chiqadigan oksidlanish stressini yengillashtirishi mumkin [69]. , 70].

Bermudagrass ildizlaridagi tuz stressi bilan past regulyatsiya qilingan genlar toifalari

Ushbu tadqiqotda pastga qarab tartibga solingan genlar mos ravishda uch vaqt punktida ham ko'p bo'lgan (2c-rasm), bu transkripsiyaning ulkan salbiy regulyatsiyasining o'simlik metabolizmi va faoliyatiga ta'sirini ko'rsatadi. Aslida, gormonlar almashinuvi, transkripsiya omillari va boshqalar kabi boyitilgan genlarning muhim toifalari. va ikkilamchi metabolizmda ko'p miqdorda past regulyatsiya qilingan genlar ham bor edi (S2-jadval). Masalan, brassinosteroid sintezi yoki degradatsiyasida (masalan, CYP450 oilasi a'zolari) va signal uzatishda (masalan, BRI) ishtirok etadigan genlar tuz stressi (S2-jadval) bilan sezilarli darajada past darajada tartibga solingan, bu esa bermudagrassda tuz reaktsiyasida ishtirok etish uchun gormonlarning o'zaro ta'sirini ko'rsatadi. ]. Bir qator TF oilalari tartibga solishni ko'rsatgan bo'lsada, boshqa TF oilalari, masalan, C2H2 va HAP bir yoki bir nechta vaqt nuqtalarida ko'p sonli pastga qarab tartibga solingan genlarni ko'rsatdi (S2-jadval). HAP transkripsiya faktori AtHAP3b va C2H2 Zat7 oqsillari qurg'oqchilikka chidamliligi va tuzlarga chidamliligini oshirish uchun birlamchi ildiz cho'zilishida asosiy rol o'ynashi haqida xabar berilgan edi. Arabidopsis, mos ravishda [72, 73].

Oldingi proteomik tadkikotlarda, NaCl bilan davolash oqsillar tarjimasini kamaytirdi, bu ko'pchilik ribosoma oqsillari bilan bog'liq transkriptlarning regulyatsiyasiga mos keladi (S3 -jadval S2 -rasm) [27, 74]. Biz, shuningdek, 1 soat tuz bilan ishlov berilgandan keyin DEGlar soni 6 soat va 24 soatdan keyin tuz bilan ishlov berilgandan ko'ra ancha yuqori ekanligini payqadik (2c, d -rasm). Genlarni va oqsil metabolizmi bilan bog'liq genlarni kodlaydigan ko'proq ribosoma oqsillari, tuzni 1 soat ushlab turgandan so'ng, past regulyatsiya qilingan genlarda sezilarli darajada ko'payib ketgan, bu shuni ko'rsatadiki, oqsil yoki aminokislotalar almashinuvida ishtirok etadigan ko'proq genlar tez va salbiy tartibga solinadi.Kinaz va ubikuitinatsiya yo'llari kabi oqsillarning translyatsion modifikatsiyasida ishtirok etadigan genlar yuqori tartibga solingan (S3-rasm). Ta'kidlash joizki, E3 RING va E3 SCF oqsillari bilan bog'liq genlarning ko'pchiligi tuz stressidan kelib chiqadi (S3 -jadval S2 -rasm), bu fermentlar tuz reaktsiyasi paytida 26S proteazomasida mustaqil bo'lishi mumkin bo'lgan tarzda ishlashi mumkinligini ko'rsatadi [75]. Protein sintezining inhibe qilinishi va oqsillarning parchalanishi erkin aminokislotalarning, ayniqsa, osmotik himoya moddasi vazifasini bajaradigan prolinning kontsentratsiyasini oshirishi mumkin. Ushbu tadqiqotda bermudagrass ildizlarida prolin miqdori NaCl ta'siridan keyin sezilarli darajada induksiya qilingan (1d -rasm). Bu erkin aminokislotalar oqsil va hujayra membranasining tuz ostida saqlanishini ta'minlaydigan dehidrin yoki poliamin sintezini boshlashi mumkin [2]. Shu bilan birga, prolin sintetikasi bilan bog'liq kategoriya unchalik ko'p emas, shuning uchun prolin metabolizmasida ishtirok etadigan genlar ushbu tadqiqotning hamma vaqtlarida muhim transkripsiya regulyatsiyasiga ega bo'lmasligi mumkin.

Bundan tashqari, tuz stressi aerob organizmlar uchun asosiy nafas yo'li bo'lgan trikarboksilik kislota tsikli (TCA) bilan bog'liq genlarning ifodasini pasaytirdi (S1a -jadval, S2 -rasm). Masalan, piruvatning atsetil-CoA ga aylanishida ishlaydigan va shu bilan glikolitik yo'lni TCA tsikli bilan bog'laydigan piruvat dehidrogenazalarni kodlovchi genlar past regulyatsiyalangan gen toifalari orasida boyitilgan (S1a-jadval S2-rasm). Shuningdek, NAD (P) H dehidrogenazalar va F1-ATPaz kabi mitoxondriyal elektron tashish zanjiri komponentlarini kodlovchi genlar ham faqat pastdan boshqariladigan gen toifalari orasida boyitilgan (S1b-jadval, S2-rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, oksidlovchi stress tufayli mitoxondriyaga zarar yetishi mumkin. Shuningdek, biz DNK sintezi va hujayraning tashkil etilishida ishtirok etuvchi genlar, ayniqsa, 1 soat va 6 soatda past regulyatsiya qilinganini payqadik (S1c, 1d-rasm). Bu genlar toifalari tuz stressi ostida o'simliklarning o'sishi va rivojlanishini ta'minlash uchun energiya va materiallarni tejash uchun birgalikda ishlashi mumkin. Bermudagrass ildizlarida tuz stressidan ijobiy va salbiy ta'sir ko'rsatadigan asosiy toifadagi genlar modeli taklif qilingan (8 -rasm). Umuman olganda, signallarni qabul qilish va transduktsiya qilishda ishtirok etuvchi signal yo'llariga tegishli genlar, masalan, signal qabul qiluvchi kinaz, gormon va signal yo'llari, NaCl ta'siridan so'ng darhol javob beradi. Oldindan javob beradigan transkripsiya omillari quyi oqim genlarini ijobiy yoki salbiy tartibga soladi. Bu tuzlarga javob beradigan gen toifalarida lipidlar almashinuvi va oqsil sintezi kabi ba'zi toifalar ancha oldin javob beradi, ikkilamchi metabolit biosintezida ishtirok etuvchi boshqa toifalar esa oxirgi vaqtda javob beradi [26, 76].

Bermudagrass ildizlariga tuz ta'sir ko'rsatadigan asosiy gen toifalarining taklif qilingan modeli. Qizil strelkalar tuz stressidan keyin salbiy ta'sir ko'rsatadigan genlarning asosiy toifalarini ko'rsatdi va yashil strelkalar ba'zi ijobiy tartibga solingan gen toifalarini ko'rsatdi. Moviy o'q signalni qabul qilishdan va tuzning javob berishidan tuzga javob berish vaqtini ko'rsatdi


StageR: differentsial ifoda va differentsial transkriptda gen darajasidagi soxta kashfiyot tezligini nazorat qilishning umumiy bosqichli usuli.

Murakkab dizaynlar va transkripsiya-rezolyutsiyali tahlillar bilan RNK ketma-ketligi bo'yicha tadqiqotlar bir gen uchun bir nechta farazlarni o'z ichiga oladi, ammo an'anaviy yondashuvlar gen darajasida soxta kashfiyot tezligini (FDR) nazorat qila olmaydi. Biz genR darajasidagi birlashtirilgan testlarning kuchini oshiruvchi va muhim genlarni post-hoc baholashga imkon beradigan, ikki bosqichli test paradigmasini taklif qiladigan "bosqichR" ni taklif qilamiz. Bu usul gen darajasida FDR nazoratini ta'minlaydi va o'zaro ta'sir effektlarini sinab ko'rish uchun quvvatni oshiradi. Transkripsiya darajasidagi tahlilda u gen darajasidagi kuchli testlarni bajaradigan, transkripsiya darajasida biologik talqinni saqlaydigan tizimni taqdim etadi. Protsedura har bir individual gipotezani birlashtirish mumkin bo'lganda qo'llaniladi, bu esa yuqori o'tkazuvchanlikdagi murakkab tajribalar uchun yagona tizimni ta'minlaydi.

Kalit so'zlar: Differentsial ifoda Differentsial transkriptdan foydalanish RNK-ketma-ketligi Bosqichli test.

Manfaatlar to'qnashuvi to'g'risidagi bayonot

Etikani tasdiqlash va ishtirok etishga rozilik
Nashrga rozilik
Raqobat manfaatlari

Mualliflar hech qanday raqobatchi manfaatlari yo'qligini e'lon qiladilar.

Nashriyot eslatmasi

Springer Nature nashr etilgan xaritalar va institutsional aloqalardagi yurisdiktsiya da'volariga nisbatan neytral bo'lib qoladi.

Raqamlar

DTU tahlilining ishlash egri chiziqlari ...

Ikki simulyatsiya tadqiqotiga asoslangan DTU tahlilining ishlash egri chiziqlari. Soxta kashfiyot…

Bosqichma-bosqich sinov paradigmasi. n ...

Bosqichma-bosqich sinov paradigmasi. n g gipotezalar gen uchun qiziq g ...

DGE simulyatsiyasini o'rganish natijalari…

Har birida beshta replikatsiya bilan limma-voom tahlilining DGE simulyatsion tadqiqot natijalari ...

Ifodaning shakli PDLIM5…

Ifodaning shakli PDLIM5 amaliy ishda gen. Ishlatilgan fraktsiya…

DTE uchun FDP-TPR ishlash egri chiziqlari ...

Simulyatsiya qilingan ma'lumotlarni DTE tahlil qilish uchun FDP-TPR ishlash egri chiziqlari. Moviy egri chiziqlar ifodalash ...


Manbalar

Konesa, A. va boshqalar. Genom biol. 17, 13 (2016).

Qonun, C.W., Chen, Y., Shi, V. va Smit, G.K. Genom biol. 15, R29 (2014).

Li, B., Ruotti, V., Styuart, R.M., Tomson, J.A. va Dewey, C.N. Bioinformatika 26, 493–500 (2010).

Trapnell, C. va boshqalar. Nat. Biotexnologiya. 28, 511–515 (2010).

Glaus, P., Xonkela, A. & Rattray, M. Bioinformatika 28, 1721–1728 (2012).

Anders, S. va Xuber, V. Genom biol. 11, R106 (2010).

Leng, N. va boshqalar. Bioinformatika 29, 1035–1043 (2013).

Robinson, MD va Smit, G.K. Bioinformatika 23, 2881–2887 (2007).

Sevgi, M.I., Xuber, V. va amp Anders, S. Genom biol. 15, 550 (2014).

Bray, N.L., Pimentel, H., Melsted, P. & amp Pachter, L. Nat. Biotexnologiya. 34, 525–527 (2016).

Turro, E., Astle, VJ va amp Tavaré, S. Bioinformatika 30, 180–188 (2014).

Trapnell, C. va boshqalar. Nat. Biotexnologiya. 31, 46–53 (2013).

Teng, M. va boshqalar. Genom biol. 17, 74 (2016).

Pastda, D. va boshqalar. PLOS One 6, e17820 (2011).

Lappalainen, T. va boshqalar. Tabiat 501, 506–511 (2013).

Soneson, C., Sevgi, M.I. & amp; Robinson, MD F1000Res. 4, 1521 (2016).

Kim, D., Langmead, B. va Salzberg, S.L. Nat. Usullari 12, 357–360 (2015).

Liao, Y., Smit, G.K. va Shi, V. Bioinformatika 30, 923–930 (2014).

Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. va Salzberg, S.L. Genom biol. 10, R25 (2009).

Köster, J. va Rahman, S. Bioinformatika 28, 2520–2522 (2012).


Tizim darajasidagi tahlil Ixodes ricinus ichak va tuprik bezlarida erta biriktirish va oziqlantirish paytida transkriptomik va proteomik murakkablikni aniqlaydi.

Garchi patogenlar odatda Ixodes ricinus kastor fasulyesi biriktirilgandan keyin birinchi 24-48 soat ichida uzatilsa-da, bu biriktirilishning dastlabki bosqichlarida Shomilning biologik javoblari haqida kam narsa ma'lum. Shomil ichi va tuprik bezlari qonni oziqlantirish va patogenni yuborishda ishtirok etadigan asosiy to'qimalardir, lekin I. ricinus uchun genomik ma'lumotlarning cheklanganligi ularning fiziologiyasini o'rganish uchun yuqori o'tkazuvchanlik usullarini qo'llashni kechiktiradi. Biz umurtqali hayvonlar uyushmasiga biriktirilganda, bu kasallik vektorining o'rta va so'lak bezlarida genlar ekspressiyasi dinamikasining misli ko'rilmagan, miqdoriy tavsifini berish uchun, keyingi avlod RNK-ketma-ketligi va yorliqsiz miqdoriy proteomika sohasidagi so'nggi yutuqlardan foydalandik. . Aniqlangan 1510 ta oqsilning 373 tasi tuprik bezlarida yuqori ifodaga ega edi, lekin faqat 110 tasi xuddi shu to'qimada yuqori darajada transkript darajasiga ega edi. Bundan tashqari, transkriptom va proteom darajasida 217 genning o'rta ichakka xos ifodasi bor edi. To'qimalarga bog'liq bo'lgan transkript, lekin oqsil emas, 885 genning 552 tasida to'plangan. Bundan tashqari, biz genlarning transkripsiyasi va tarjimasida ishtirok etadigan oqsillar tarkibiga kiruvchi tupurik bezlarini boyitishni kashf qildik, bu to'qimaning sekretorlik roliga mos keladi, bu topilma tupurik bezlarida t-RNKning quyi Shomil vakili topilishi bilan ham mos keladi. o'rta ichak. O'rta ichak, o'z navbatida, yutilgan qonni joylashtirish va metabolizatsiyalash uchun uning mexanik yaxlitligini qo'llab -quvvatlaydigan metabolik komponentlar va oqsillarga boyitilgan. Artropod ektoparazitlari tomonidan gematofagiyani qo'llab-quvvatlaydigan fiziologik hodisalarni tushunishdan tashqari, biz Shomil, umurtqali hayvonlar va Shomil qo'zg'atuvchilari o'rtasida joylashgan 1500 dan ortiq oqsillarni topdik. Shunday qilib, bizning ishimiz ushbu Shomil turining transmisyon tsikliga asoslangan genetika haqidagi bilimlarni sezilarli darajada yaxshilaydi, bu esa Shomil orqali yuqadigan kasalliklarga qarshi kurashishning muqobil usullarini ishlab chiqish uchun muhim qadamdir.

© 2014 Amerika biokimyo va molekulyar biologiya jamiyati, Inc.


Biz inson embrion ildiz hujayralarida (hESC) transkriptom dinamikasini tavsiflash uchun bitta hujayrali transkript tahlilining sifat va miqdoriy kuchini namoyish etamiz. Yagona hujayrali tahlil yordamida hujayralarni saralash va identifikatsiyalashda foydalanish uchun noyob uyali profillarni muntazam aniqlash mumkin, turg'un hujayralarni farqlash modellarini ko'paytirish potentsiali ko'rsatilishi va pluripotensiyadan chiqib ketadigan ildiz hujayralarining xatti-harakatlari tushuntirilishi mumkin. H9 hESC ning uchta madaniyat sharoitida farqlanishini bitta hujayrali tahlil yordamida biz uchta protokolda mezendodermal markerlarning vaqtinchalik ifodasini, so'ngra embrional endoderma va embriondan tashqari endoderma belgilarining barqaror ifodasini aniqladik. Bizning bitta hujayrali profilimiz har xil turdagi har xil turdagi transkripsiya va vaqtinchalik heterojenlik belgilarini ko'rsatadigan aralash turdagi populyatsiyalarni ko'rsatadi. Qizig'i shundaki, biz har qanday sharoitda ham pluripotensiyani, ham nasl-nasabni farqlashni tartibga soluvchi markerlarning keng va uzoq vaqt davomida birgalikda ifodalanishini kuzatamiz va shuni aniqlaymizki, pluripotensiya belgilarining transkriptlari ko'p kunlar davomida ko'p hujayralarda aniqlanadi. Nihoyat, biz ko'rsatdiki, farqlanmagan hESC koloniyalaridan olingan hujayralar uchta transkript kohortasi bilan tavsiflangan izchil gen ekspressiv profillarini ko'rsatadi: bir xil, yo'q va vaqti -vaqti bilan aniqlanmagan xabarlar, va bu guruhlarning genlari a'zoligi va ularning hESC promotor xromatin holati o'rtasida ajoyib korrelyatsiya mavjud. , ikkilamchi targ'ibotchilar bilan vaqti -vaqti bilan transkriptlar ustunlik qiladi.

  • gen ifodasi
  • transkripsiya, genetik
  • embrion ildiz hujayralari
  • endoderma
  • ildiz hujayralari
  • heterojenlik
  • aktivinlar
  • hujayralarni ajratish
  • xromatin
  • embrion
  • gen ifodasini profillash
  • genlar
  • onkogenlar


Videoni tomosha qiling: Лекция 5. Транскрипция. Биосинтез белка. (Yanvar 2022).